【摘要】：小反芻獸疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由副黏病毒科麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一種急性接觸性和高度致死性的烈性傳染病。其特征是發(fā)熱急、高熱稽留、口炎、腹瀉和肺炎。對(duì)綿羊、山羊等小反芻動(dòng)物危害嚴(yán)重,山羊發(fā)病嚴(yán)重,易感羊群的發(fā)病率和死亡率可達(dá)100%,野生動(dòng)物也可感染。是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列出的通報(bào)(notifiable)疫病,也是我國(guó)農(nóng)業(yè)部《一、二、三類(lèi)動(dòng)物疫病病種名錄》中的一類(lèi)動(dòng)物疫病。此病1942年首先在非洲的科特迪瓦發(fā)生,目前在全球70多個(gè)國(guó)家流行,包括中東、非洲和亞洲大部,是一種跨境動(dòng)物傳染病,對(duì)發(fā)展中國(guó)家畜牧生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的影響。鑒于PPR目前在全球的傳播形勢(shì),2015年OIE與世界糧農(nóng)組織(FAO)正式啟動(dòng)了PPRV根除計(jì)劃(GCES),計(jì)劃于2030年前全球根除PPR。我國(guó)于2007年7月首次在西藏阿里地區(qū)暴發(fā)PPR疫情,自2013年11月起小反芻獸疫在我國(guó)多個(gè)省市地區(qū)連續(xù)發(fā)生,疫情傳播快、跨度大、風(fēng)險(xiǎn)高,為此,農(nóng)業(yè)部于2015年12月印發(fā)了《全國(guó)小反芻獸疫消滅計(jì)劃(2016—2020年)》,對(duì)國(guó)內(nèi)該病的防控工作提出了新的要求�；�2010年人類(lèi)實(shí)現(xiàn)牛瘟全球根除的成功經(jīng)驗(yàn),敏感快速的診斷方法對(duì)于PPR的防控及根除至關(guān)重要。傳統(tǒng)診斷方法如病毒分離、血清中和試驗(yàn)、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)等,或費(fèi)時(shí)費(fèi)力,或特異性和敏感性不高;新型診斷方法如RT-PCR、熒光定量RT-PCR等試驗(yàn),雖然較為快速敏感,但需要特殊設(shè)備且只能由專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員在實(shí)驗(yàn)室中完成,不能滿足基層實(shí)驗(yàn)室或臨床現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。為實(shí)現(xiàn)2018年,全國(guó)所有免疫省份達(dá)到免疫無(wú)小反芻獸疫區(qū)的要求,實(shí)驗(yàn)室或基層現(xiàn)場(chǎng)一方面需要對(duì)大批量免疫動(dòng)物進(jìn)行快速特異性診斷、及時(shí)評(píng)價(jià)免疫效果,另一方面由于國(guó)內(nèi)PPRV弱毒活疫苗(Nigeria75/1株)的使用,實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中難以區(qū)分疫苗株和野毒株,不利于PPR疫情的流行病學(xué)調(diào)查及最后階段的防控根除。為此,本研究針對(duì)上述實(shí)際工作需求,探索建立了一套適用于基層根除防控的實(shí)用快速檢測(cè)方法,包括第一步在臨床現(xiàn)場(chǎng)對(duì)PPRV免疫后效果進(jìn)行快速評(píng)估(Post vaccination evaluaton,PVE),其次在實(shí)驗(yàn)室對(duì)感染情況進(jìn)一步進(jìn)行血清學(xué)篩查(流行病學(xué)調(diào)查),如果發(fā)現(xiàn)PPRV感染,則對(duì)PPRV疫苗株及野毒株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室鑒別診斷(Differentiation of infected and vaccinated animals,DIVA),通過(guò)上述檢測(cè),掌握免疫情況及感染狀況,為下一步的防控措施提供科學(xué)依據(jù),是小反芻獸疫最終實(shí)現(xiàn)凈化根除檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用型研究。具體研究?jī)?nèi)容包括:使用水溶性羧基功能化量子點(diǎn)(QDs)作為熒光標(biāo)記,通過(guò)酰胺鍵與鏈球菌G蛋白(SPG)共軛,經(jīng)QDs標(biāo)記的SPG與PPRV抗體(IgG)結(jié)合,再與檢測(cè)線上的昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)的AcNPV-PPRV-N重組蛋白發(fā)生免疫反應(yīng),在365nm的紫外線激發(fā)光下可見(jiàn)高亮的熒光帶,建立了檢測(cè)PPRV血清抗體的新型超敏熒光量子點(diǎn)免疫層析快速檢測(cè)技術(shù)(QDs-LFIAS)。該方法抗體濃度與熒光強(qiáng)度直接關(guān)聯(lián),使用成本低廉、維護(hù)保養(yǎng)簡(jiǎn)單的儀器在15min內(nèi)讀取結(jié)果。評(píng)估其分析敏感性(Analytical Sensitivity,ASe)明顯優(yōu)于競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法(Competitive ELISA,C-ELISA)(OIE推薦的血清學(xué)檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn))及膠體金免疫層析技術(shù)(Immunochromatographic Strip ICS)。檢測(cè)藍(lán)舌病、犬瘟熱、羊痘及口蹄疫病毒陰性,分析特異性(Analytical Specificity,ASp)100%。與C-ELISA檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)臨床樣本,評(píng)估其診斷特異性(Diagnostic Specificity,DSp)及敏感性(Diagnostic Sensitivity,DSe)分別為99.47%和97.67%,一致性良好,適用于臨床現(xiàn)場(chǎng)對(duì)小反芻獸疫的免疫效果進(jìn)行快速評(píng)價(jià)(PVE)。2.小反芻獸疫病毒雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)快速檢測(cè)方法的建立及評(píng)估利用免疫雜交瘤細(xì)胞技術(shù),篩選獲得穩(wěn)定分泌PPRV單克隆抗體(Monoclonial Antibody,MAb)的雜交瘤細(xì)胞株(5B11),利用該細(xì)胞株產(chǎn)生的針對(duì)PPRV N抗原的特異性MAb以及PPRV疫苗株全病毒免疫蛋雞獲取的PPRV特異性雞卵黃免疫球蛋白(egg yolk immunoglobulin,IgY),建立了檢測(cè)血清中PPRV抗原的雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)新型快速實(shí)用檢測(cè)方法。評(píng)估其分析特異性(ASp)結(jié)果顯示,該方法檢測(cè)PPRV陽(yáng)性樣品結(jié)果為陽(yáng)性,檢測(cè)藍(lán)舌病病毒、鹿流行性出血病病毒、水皰性口炎病毒、赤羽病病毒、口蹄疫病毒為陰性,特異性100%。與RT-PCR方法同時(shí)檢測(cè)臨床樣品,評(píng)估其DSp和DSe分別為99.2%和93.9%,兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合率為98.1%。重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果批內(nèi)變異系數(shù)在2.14%~6.18%之間,批間變異系數(shù)在4.82%~8.37%之間,表明建立的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法重復(fù)性良好,適用于對(duì)小反芻獸疫免疫帶毒或野毒感染情況進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室快速血清學(xué)篩查及流行病學(xué)調(diào)查。3.區(qū)分小反芻獸疫疫苗株與野毒株的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR鑒別診斷方法的建立及評(píng)估對(duì)我國(guó)西藏地區(qū)使用的PPRV弱毒活疫苗毒株(Nigeria75/1)進(jìn)行全基因組序列測(cè)定,分析比較已報(bào)道的PPR西藏野毒株的基因組核酸序列,選擇兩者差異較大的特異區(qū)段設(shè)計(jì)了2套實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的引物和TaqMan探針?lè)謩e用于檢測(cè)PPRV疫苗株和野毒株,篩選最佳的引物、探針濃度,優(yōu)化反應(yīng)體系和條件,針對(duì)我國(guó)PPRV防控實(shí)際需要,建立了區(qū)分小反芻獸疫活疫苗株與野毒株(differentiation of infected1.小反芻獸疫血清抗體超敏熒光量子點(diǎn)免疫層析快速檢測(cè)技術(shù)(QDs-LFIAS)的建立及評(píng)估and vaccinated animals,DIVA)的新型實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR快速鑒別診斷方法。特異性分析結(jié)果顯示,檢測(cè)疫苗株的熒光RT-PCR只能檢測(cè)到PPR疫苗毒株,檢測(cè)對(duì)照病毒及PPR野毒株均為陰性;檢測(cè)野毒株的熒光RT-PCR只能檢測(cè)到PPR野毒株,檢測(cè)對(duì)照病毒及PPR疫苗株均為陰性,說(shuō)明建立的上述鑒別診斷方法特異性強(qiáng)。靈敏度(Limit of detection,LOD)分析表明,檢測(cè)疫苗株的熒光RT-PCR最低檢出核酸數(shù)量級(jí)為1.38pg/μL,檢測(cè)野毒株的熒光RT-PCR最低檢出核酸數(shù)量級(jí)為0.16pg/μL,適用于我國(guó)目前防控PPRV對(duì)PPRV感染動(dòng)物及免疫動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室鑒別診斷(DIVA)及流行病學(xué)調(diào)查,是我國(guó)在2020年前最終實(shí)現(xiàn)PPRV根除的必要技術(shù)手段。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S855.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2387441