【摘要】：病毒侵染產生的大量病毒蛋白阻礙細胞轉運功能,未/錯折疊蛋白在內質網腔蓄積導致內質網應激(ER stress),誘發(fā)細胞防衛(wèi)信號未折疊蛋白應答(UPR),或導致細胞程序性死亡(PCD)。有研究表明植物病毒通過調控UPR信號完成侵染復制,寄主會以PCD主動消亡的方式抵御病毒。但不同病毒調控UPR的信號機制及信號強弱尚不明確,尋找UPR和PCD的關鍵調節(jié)子,是抗病毒研究的重要方向。為此本文開展了 CMV誘導煙草ER stress及調控因子NbbZIP28的研究。首先,采用苗期接種鑒定法篩選抗CMV煙草資源,供試的3000余份煙草種質多表現中感和高感,獲得1份中抗材料。CMV經PEG提純和介導侵染煙草懸浮細胞BY-2,伊文斯蘭染色鑒定細胞存亡。結果顯示:CMV侵染懸浮細胞后48-72 h,細胞死亡率顯著高于對照PBS,72 h達到90-100%;侵染原生質體后24 h導致原生質體完全解體。因不易區(qū)分自然凋亡的細胞和被病毒侵染的細胞及繼代問題,故采用病毒-植株體系研究ER stress。為明確利用液泡膜復制的CMV是否誘導寄主ER stress,在CMV-IB侵染三生煙或本氏煙體系中,采用qRT-PCR檢測ERstress相關基因的表達量,顯示接種 CMV 后約 12-48 h,ER stress 相關基因顯著上調。ER mark(mCherry-HDEL)瞬時轉染48 h后激光共聚焦觀察ER形態(tài),發(fā)現接種CMV后5-10 d,ER膜結構發(fā)生了明顯的重排和增生。電鏡觀察發(fā)現病變細胞葉綠體降解、線粒體腫脹,且沿液泡膜的微自噬和細胞質中的巨自噬結構增多。上述結果表明CMV侵染通過激活ER stress基因、改變ER膜形態(tài)和產生細胞自噬而誘導寄主細胞ER stress。其次,研究表明ER stress相關的UPR是細胞內的保守防衛(wèi)反應,擬南芥AtbZIP28是ER stress誘導劑衣霉素誘導的UPR信號分子。為明確病毒侵染應激下的NbbZIP28信號,采用RACE和同源克隆鑒定基因,NbbZIP28-GFP、NbbZIP28ΔC-GFP和mCherry-HDEL瞬時轉染及細胞核DAPI染色亞細胞定位蛋白。結果顯示,NbbZIP28編碼一個812個氨基酸的C端含跨膜區(qū)TMD及N端含亮氨酸拉鏈bZIP結構域的膜蛋白。其前體蛋白定位于ER膜,去TMD及其后C端序列的截短蛋白定位于細胞核。采用VIGS體系沉默NbbZIP28并檢測其對UPR信號和病毒侵染的調控作用。結果顯示,本氏煙接種TMV或CMV后48h,NbbZIP28的轉錄水平顯著提高。與野生型相比,NbbZIP28沉默植株無顯著表型變化。在病毒侵染早期,沉默植株中病毒的積累量顯著提高;UPR基因(包括NbbZIP28的下游靶基因BiP和NF-YC2)顯著被抑制、后期逐漸恢復甚至提高。這顯示NbbZIP28為病毒誘導的UPR信號調節(jié)子,但不是唯一調節(jié)子,在病毒侵染早期,通過激活UPR信號提高寄主防衛(wèi)反應以抵御病毒。最后,為驗證UPR信號分子NbbZIP28調控病毒侵染的作用,經Crispr-cas9基因編輯和煙草遺傳轉染創(chuàng)建本氏煙NbbZIP28敲除突變體。突變體在發(fā)芽率、植株性狀上與野生型無顯著差異。對病毒的敏感性檢測顯示,寄主接種病毒早期,突變體植株中病毒(TMV-GFP、CMV)的積累量較野生型顯著提高。鹽、旱脅迫處理種子,發(fā)現突變體與野生型無顯著差異。上述結果表明,NbbZIP28為病毒侵染應激中的UPR調控因子,在病毒侵染早期,提高寄主基礎防衛(wèi)反應,延緩了病毒的侵染。
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【學位授予單位】：沈陽農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S435.72

【參考文獻】

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本文編號：2285133