【摘要】：大豆(Glycine max(L.)Merr.)是重要的油料作物,也是我國的戰(zhàn)略性物資,在我國種植業(yè)結構調整和民族種業(yè)發(fā)展中占有重要地位。我國南方春大豆種子生理成熟期往往會遇到高溫多雨的夏季,導致種子發(fā)生田間劣變,嚴重影響了春大豆的產(chǎn)量和品質。植物轉錄因子(如TALE家族的兩個成員KNOTTED-like homeobox (KNOX)和 BEL1-likehomeobox (BELLorBLH))在植物生長發(fā)育以及應答生物和非生物脅迫過程中具有重要的作用。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),大豆KNOX家族成員GmSBH1能夠參與調控植株的幼苗形態(tài)建成、生長發(fā)育以及種子田間劣變抗性過程。本文擬以田間劣變抗性品種湘豆3號的大豆種子為材料,構建高溫高濕酵母雙雜交cDNA文庫;以GmSBH1蛋白為誘餌,篩選出15個與種子田間劣變相關的互作蛋白;利用GST pull-down和雙分子熒光互補(BiFC)技術分別從體外和體內驗證大豆BELL家族轉錄因子GmBLH4與GmSBHl的互作關系;通過系統(tǒng)進化分析、蛋白質結構和功能分析初步明確了 BELL家族在大豆發(fā)育過程中的作用和進化特點;利用熒光定量、亞細胞定位、啟動子分析以及轉基因功能驗證等技術闡明了GmBLH 基因參與植物形態(tài)建成以及種子田間劣變過程,為大豆TALE家族參與種子田間劣變抗性的調控網(wǎng)絡研究提供理論依據(jù)。主要研究結果如下:1、以田間劣變抗性品種湘豆3號為材料,采用同源重組的方法,構建大豆生理成熟期(R7期)高溫高濕(40×2℃/30±2℃、相對濕度95±5%晝/70±5%夜、10 h晝/14h夜)酵母雙雜交cDNA文庫,文庫多樣性和均一性均較好,文庫效率大于1.0×106,適合用于蛋白與蛋白之間相互作用的大規(guī)模篩選。2、以實驗室前期分離并鑒定的種子田間劣變相關轉錄因子GmSBH1為誘餌蛋白,與1中的酵母cDNA文庫進行雙雜交,通過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和X-gal染色共篩選到49個陽性克隆;提取49個陽性克隆的質粒并轉化大腸桿菌,擴繁后進行測序和比對,得到15個可能與GmSBH1互作的蛋白;利用NCBI數(shù)據(jù)庫和UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫檢索15個互作蛋白的功能,分別為種子成熟蛋白、種子貯藏蛋白、發(fā)育相關蛋白、蛋白酶抑制劑和功能未知蛋白。3、從15個互作蛋白中挑選植物發(fā)育相關基因召EL1-LIKE HOMEODOMAIN 4 (GmBLH4),進化樹分析表明大豆基因組中含有34個BELL家族基因,并且發(fā)現(xiàn)GmBLH4和擬南芥中的BLH4(SAW2)同源性較高;基因表達譜分析顯示GmBELLs在大豆葉片、根、莖、花、莢、根瘤、根毛、種子和頂端分生組織(SAM)中差異表達;根據(jù)NCBI和Phytozome數(shù)據(jù)庫提交的GmBLH4的CDS序列,從大豆cDNA中分離出其完整編碼區(qū)域,序列分析顯示該基因的ORF全長2022bp,編碼674個氨基酸;蛋白質結構域分析顯示其蛋白包含SKY結構域、典型的BEL保守域結構以及Homeodomain結構域;Signa1P網(wǎng)站預測顯示GmBLH4不具有信號肽;二級結構預測顯示,GmBLH4序列存在α-螺旋(38.58%)、β-轉角(6.68%)、延伸鏈(10.39%)和無規(guī)卷曲(44.36 %);基于煙草表皮細胞和大豆原生質體轉化體系的亞細胞結構定位表明,GmBLH4定位于細胞核中。4、利用雙分子熒光互補實驗(BiFC)和GST pull-down以及Western blot技術驗證,無論體內還是體外GmBLH4蛋白都能特異地結合GmSBH1蛋白。5、GmBLH4與GmSBH1互作關系與特點的研究結果表明,GmSBH1的保守結構域 MEINOX (KNOX1 和 KNOX2)和 Homeodomain 都能夠結合 GmBLH4蛋白,但是GmSBHl編碼區(qū)完整存在時的活性最高;GmBLH4蛋白中N端(包含SKY和BEL結構域)和C端(Homeodomain結構域)也有利于其結合GmSBHl蛋白。以上結果說明TALE家族的保守域對于KNOX/BELL二聚體的形成很重要。6、GmBLH4基因在大豆中的組織特異性表達結果表明,無論是抗性品種湘豆3號還是不抗品種寧鎮(zhèn)1號,GmBLH4基因均在花中表達量最高,根中次之,種子表達量最低。啟動子驅動下的GUS基因染色結果顯示,GmBLH4在擬南芥的花、幼苗的根和頂端分生組織中高表達,在莢、成熟葉片及種子中不表達。高溫高濕脅迫下,GmBLH4基因在寧鎮(zhèn)1號中脅迫處理48h后顯著上調表達,而在湘豆3號中處理168 h后表達才能達到顯著水平。以上結果說明GmBLH4基因可能參與調控大豆頂端分生組織和花器官的生長發(fā)育,同時也可能參與春大豆種子田間劣變過程。7、異源表達結果表明,GmBLH4基因過表達導致擬南芥葉片卷曲、角果變短以及產(chǎn)量降低等。石蠟切片結果顯示轉基因植株葉片的細胞排列松散、細胞間隙較大,柵欄細胞變短變細,海綿細胞分布不規(guī)則,近、遠軸細胞尤其是遠軸細胞變得更小、排列更加緊密。轉GmBBLH4基因株系經(jīng)高溫高濕脅迫后,種子發(fā)芽率和生活力明顯高于野生型和突變體blh4植株,與轉GmSBH1基因株系種子的耐逆性相當。以上結果表明GmBLH4能夠與GmSBHl形成異源二聚體,并參與影響植物葉片的正常發(fā)育和種子田間劣變過程。
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【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S565.1
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本文編號：2261970