【摘要】：本研究設計三個中草藥飼料添加劑,以中國美利奴羊(新疆軍墾型)為實驗動物,開展添加飼喂試驗,檢測常規(guī)肉品質指標、鮮味物質肌苷酸及其相關代謝物的含量、影響肉風味的脂肪酸的組成和含量,篩選出本研究中能夠調節(jié)中國美利奴羊(新疆軍墾型)肉品質和風味的最佳方劑;對部分肉質性狀候選基因進行定量RT-PCR檢測,分析心型脂肪酸結合蛋白基因(H-FABP)外顯子2的單核苷酸多態(tài)性與中國美利奴羊(新疆軍墾型)肉質性狀的相關性,初步探討中草藥添加劑影響綿羊肉品質和風味的分子機理;建立綿羊前體脂肪細胞的體外培養(yǎng)模式,進行中草藥方劑水提物干預,分析其對前體脂肪細胞增殖與分化的影響;最后對篩選出的中草藥方劑進行安全性評價,為其今后推廣、用以生產綠色無公害且風味獨特的畜產品提供依據。試驗主要內容和結果如下:1.選用32只10月齡中國美利奴羊(新疆軍墾型),隨機分為4組。試驗1、2和3組在基礎日糧中分別添加1%方劑Ⅰ、1%方劑Ⅱ和1%方劑Ⅲ;試驗4組為對照組,飼喂基礎日糧;進行為期60 d的飼養(yǎng)試驗,測定常規(guī)肉品質指標。結果表明:三個自擬中草藥添加劑均能不同程度的提高中國美利奴羊(新疆軍墾型)背最長肌中脂肪含量和肌纖維密度,下調肌纖維直徑,從而改善中國美利奴羊(新疆軍墾型)肉的嫩度和多汁性,其中以方劑Ⅲ效果較為顯著。2.采用高效液相色譜法檢測肉樣中肌苷酸(IMP)及其相關代謝物三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷酸(AMP)、肌苷(INO)和次黃嘌呤(HYP)的含量。結果表明:所有試驗肉樣中均不含ATP成分,ADP和AMP的含量亦很低,且各組數據無顯著性差異;三個中草藥添加劑均能不同程度的提高綿羊肉中IMP及其分解產物的含量,其中方劑Ⅲ組肉樣的IMP、INO和校正肌苷酸值(IMPc)極顯著的高于空白對照組,與方劑II組和方劑Ⅰ組相比亦存在顯著性差異。結果提示,方劑III能通過影響肌苷酸的含量而改善中國美利奴羊(新疆軍墾型)肉的鮮味。3.采用氣相色譜法檢測肉樣中脂肪酸的組成與含量,以對比混合脂肪酸甲酯標準品的相對保留時間進行定性,以各脂肪酸的峰面積相對百分含量進行定量。結果表明:在各組實驗肉樣中共檢測出14種脂肪酸,其中有4種飽和脂肪酸,5種單不飽和脂肪酸,5種多不飽和脂肪酸,含量較高的脂肪酸有油酸(C18:1n9c)、硬脂酸(C18:0)、軟脂酸(C16:0)、順-10-十七碳烯酸(C17:1),約占總脂肪酸含量的77.201~80.453%;三個中草藥方劑均能不同程度的降低膻味脂肪酸和總飽和脂肪酸的含量,提高對機體健康有益的不飽和脂肪酸的含量和比例;相比之下,方劑Ⅱ在提高肉質營養(yǎng)價值方面較顯著,方劑Ⅲ在改善羊肉膻味、平衡各脂肪酸比例方面較有優(yōu)勢。4.以心型脂肪酸結合蛋白基因(h-fabp)、脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白基因(a-fabp)、脂蛋白脂酶基因(lpl)、激素敏感酯酶基因(hsl)、脂肪酸合成酶基因(fas)、解偶聯蛋白3基因(ucp3)為肌內脂肪(imf)候選基因,以腺苷琥珀酸裂解酶基因(adsl)為肌苷酸(imp)候選基因,以鈣蛋白酶i基因(calpaini)和鈣蛋白酶抑制蛋白基因(cast)為肌肉嫩度候選基因,采用rt-pcr和實時熒光定量pcr(qrt-pcr)技術對各基因mrna進行定量分析,探討中草藥添加劑對各基因相對表達水平的影響,結合前期肉品質、風味指標的測定結果,分析各候選基因相對表達水平與肉品質、風味性狀的相關性。結果表明:方劑Ⅱ可促進h-fabp、a-fabp基因表達,方劑Ⅲ可促進h-fabp、fas、adsl、calpaini基因表達,方劑Ⅲ可降低hsl基因表達,三個中草藥方劑對lpl、ucp3、cast基因表達均無顯著影響。h-fabp、lpl、fas基因表達與imf呈正相關,hsl、ucp3基因表達與imf呈負相關,a-fabp基因表達與imf不相關。adsl基因表達與imp、矯正肌苷酸(impc)呈正相關。calpaini基因表達與肌纖維直徑呈負相關,與肌纖維密度呈正相關;cast基因表達與肌纖維直徑不相關,與肌纖維密度呈負相關。結果提示,本試驗所用中草藥添加劑可促進生脂基因表達、抑制脂解基因表達、促進鮮味和嫩度候選基因表達,從而增加imf和鮮味物質含量,并提高肌肉組織的嫩度,其中方劑Ⅲ作用最顯著。5.利用聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態(tài)(pcr-sscp)技術檢測中國美利奴羊(新疆軍墾型)心型脂肪酸結合蛋白基因(h-fabp)外顯子2的單核苷酸多態(tài)性(snps),分析其與肌內脂肪(imf)含量、肌纖維直徑和肌纖維密度的相關性。結果表明:中國美利奴羊(新疆軍墾型)h-fabp基因外顯子2有aa、ab和bb3種基因型,aa型和bb型在778位均發(fā)生了c缺失,939位均發(fā)生了a→g轉換,bb型還在789位發(fā)生了t→c轉換,該突變導致所編碼氨基酸發(fā)生了纈氨酸→丙氨酸的替換;bb型為肌內脂肪(imf)的優(yōu)勢基因型,與ab型相比差異顯著,與aa型相比差異極顯著;bb型與肌纖維直徑存在負相關。結果提示,中國美利奴羊(新疆軍墾型)h-fabp基因外顯子2具有多態(tài)性,該基因可能是中國美利奴羊(新疆軍墾型)肉質性狀的主效基因,或者與控制這些性狀的主效基因相連鎖。6.采用組織塊法和單層細胞培養(yǎng)法對中國美利奴羊(新疆軍墾型)前體脂肪細胞進行原代和傳代培養(yǎng),并對其進行形態(tài)學觀察、生長曲線測定、油紅o染色鑒定及脂肪含量測定;用四甲基偶氮唑鹽(mtt)方法測定改善綿羊肉品質和風味的最佳方劑Ⅲ對前體脂肪細胞增殖的影響,用油紅o染色法測定中草藥方劑Ⅲ對細胞內脂肪積聚的影響。結果表明:組織塊法和單層細胞培養(yǎng)法均能培養(yǎng)出成分均一、增殖旺盛的前體脂肪細胞,單層細胞培養(yǎng)法更能在短期內更快獲得大量細胞;中草藥方劑Ⅲ可促進綿羊前體脂肪細胞的增殖和分化。7.配置中草藥方劑Ⅲ水煎劑,以50、75、100和150 mg/10 g體重的劑量分別給4個試驗組小鼠一次灌服,連續(xù)觀察14天,記錄小鼠的中毒癥狀和死亡數,并計算半數致死量(LD50);另取40只小鼠,隨機分為2組,給藥組以最大濃度(1.0 g/mL)和最大容積(0.4 mL/10 g體重)1次灌服,對照組用以等體積生理鹽水,給藥后連續(xù)觀察14 d,檢測最大給藥量;另取160只小鼠,分別以高劑量(30 mg/10 g體重)、中劑量(15 mg/10 g體重)、低劑量(7.5 mg/10 g體重)灌胃給藥,每天1次,連續(xù)給藥30 d,對照組灌服等體積生理鹽水,測定小鼠體重、血常規(guī)指標、血液生化指標和臟器系數。結果表明:急性毒性試驗各劑量組均無小鼠死亡,無法計算LD50,經口給藥的最大劑量為400mg/10 g體重,表明該制劑無毒。30 d喂養(yǎng)試驗中,藥物處理組小鼠血常規(guī)、血液生化指標和臟器系數與對照組相比無顯著差異,肉眼觀察實質器官無異常病變;各藥物組小鼠體重明顯增加,其中中劑量組與空白對照組相比差異顯著,說明該試驗藥物有增加食欲,促進生長的作用。結果提示,中草藥方劑Ⅲ對動物機體無毒副作用,安全可靠,可在畜牧業(yè)生產中推廣應用。
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【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S826.5
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本文編號：2253442