發(fā)布時(shí)間：2018-09-18 18:44

【摘要】：犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)感染引起的犬瘟熱(Canine distemper,CD)是一種多種屬動(dòng)物共患傳染病,不同動(dòng)物對(duì)CDV易感性和致死率不同。因毛皮動(dòng)物(貉、狐和水貂)是CDV自然易感宿主,該病一直是我國毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的“頭號(hào)殺手”。H蛋白為病毒主要保護(hù)性抗原蛋白,除在介導(dǎo)病毒毒力、SLAM/Nectin-4受體識(shí)別和輔助F蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞膜融合中發(fā)揮重要作用外,編碼基因的高變異性也使其成為CDV基因分型及遺傳變異研究的主要靶基因。為建立用于病毒動(dòng)物致病性研究及疫苗免疫效力評(píng)價(jià)的CDV毛皮動(dòng)物致病模型,本研究用我國CDV主要流行基因型(Asia-1型)LN(10)1株實(shí)驗(yàn)感染3組狐貍、貉和水貂(每組5只)。通過設(shè)置評(píng)價(jià)毒力和免疫抑制指標(biāo)的賦分系統(tǒng),建立了CDV感染毛皮動(dòng)物的致病模型。試驗(yàn)結(jié)果表明CDV對(duì)3種動(dòng)物致病性(毒力和免疫抑制)差異顯著(P0.05):感染貉出現(xiàn)明顯發(fā)熱、結(jié)膜炎等典型CD癥狀和病理變化并于15 dpi內(nèi)100%(5/5)死亡,獲得高致病分?jǐn)?shù)(2.6和2.9);狐貍表現(xiàn)出相對(duì)溫和的CD癥狀并于21 dpi內(nèi)40%(2/5)死亡,獲得中等致病分?jǐn)?shù)(2.15和2.25);而水貂僅顯示溫和CD癥狀并于21 dpi內(nèi)全部存活,獲得低致病分?jǐn)?shù)(0.9和1.95)。此外,死亡和存活動(dòng)物IFN-γ和IL-4在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上分別表現(xiàn)下調(diào)和上調(diào);發(fā)病動(dòng)物TNF-ɑ轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),表明CDV對(duì)動(dòng)物致病性差異與細(xì)胞因子變化具有相關(guān)性。為闡明近年來我國毛皮動(dòng)物CD頻繁暴發(fā)的原因,本研究對(duì)2011-2013年來自我國山東、河北、遼寧和黑龍江省16份水貂、狐貍和貉源CDV-H基因序列分析表明:與2012年之前的CDV流行株不同,10株來自山東省的CDV-H蛋白與SLAM受體的結(jié)合區(qū)(RBS)發(fā)生了I542N和Y549H突變,在系統(tǒng)進(jìn)化樹上處于Asia-1基因型獨(dú)立遺傳分支,我們將其命名為CDV變異株(HI542N/Y549H)。三維結(jié)構(gòu)分析表明Y549H突變改變了H蛋白與水貂SLAM(mSLAM)的分子間作用力,I542N突變導(dǎo)致H蛋白542-544位產(chǎn)生了一個(gè)潛在N-連接糖基化位點(diǎn)。通過對(duì)CDV-H基因群體進(jìn)化分析顯示變異株2006年起源于我國毛皮動(dòng)物,Y549H突變?cè)贖基因進(jìn)化過程中受到選擇壓力影響。該突變株暴發(fā)可能預(yù)示著CDV在宿主或免疫壓力下對(duì)毛皮動(dòng)物適應(yīng)性增強(qiáng)。為評(píng)價(jià)CDV變異株對(duì)毛皮動(dòng)物致病性和疫苗免疫保護(hù)效果,基于我們建立的CDV動(dòng)物致病模型,本研究對(duì)CDV變異株SD(14)7和經(jīng)典株LN10(1)1進(jìn)行動(dòng)物感染試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CDV變異株對(duì)毛皮動(dòng)物(尤其水貂)毒力(發(fā)熱、死亡率和病理變化等)和誘導(dǎo)免疫抑制(淋巴細(xì)胞減少癥、抑制中和抗體和拮抗細(xì)胞因子表達(dá)等)水平有所增強(qiáng),但當(dāng)前疫苗能提供免疫動(dòng)物對(duì)該變異株的攻毒保護(hù)。我們通過對(duì)2株CDV-H基因542和549位氨基酸人工突變和回復(fù)突變、CDV-H蛋白與mSLAM免疫共沉淀及細(xì)胞融合試驗(yàn),在H蛋白表達(dá)、受體親和力和細(xì)胞感染水平來探究氨基酸突變對(duì)病毒生物學(xué)特性的影響。研究結(jié)果表明:(1)I542N突變未使H蛋白在該位點(diǎn)被糖基化修飾;(2)I542N和Y549H突變降低了H蛋白表達(dá)水平但增強(qiáng)了H蛋白與mSLAM相互作用。(3)I542N和Y549H突變未增強(qiáng)CDV-H/F蛋白對(duì)表達(dá)mSLAM細(xì)胞的融合能力。綜上研究表明,近年來我國毛皮動(dòng)物CD頻繁暴發(fā)可能是由于強(qiáng)毒力CDV變異株的出現(xiàn),初步揭示了CDV變異株對(duì)毛皮動(dòng)物(尤其水貂)致病性增強(qiáng)的分子機(jī)制。
[Abstract]:Canine distemper (CD) caused by Canine distemper virus (CDV) infection is a common infectious disease of many animals. Different animals have different susceptibility and mortality to CDV. Because fur animals (mink, Fox and mink) are the natural susceptible hosts of CDV, the disease has been the "top killer" of fur animal breeding industry in China. Proteins are the main protective antigen proteins of viruses, which play an important role in mediating virulence, SLAM/Nectin-4 receptor recognition and assistant F protein-induced cell membrane fusion. The high variability of the coding genes also makes them the main target genes for CDV genotyping and genetic variation research. In this study, three groups of foxes, minks and minks (5 in each group) were experimentally infected with LN (10), a major epidemic genotype of CDV (Asia-1), in China. The pathogenic model of CDV infection in fur animals was established by setting up a scoring system for evaluating virulence and immunosuppressive index. Pathogenicity (virulence and immunosuppression) of the infected raccoons were significantly different (P 0.05). Typical CD symptoms and pathological changes such as conjunctivitis occurred in infected raccoons, and 100% (5/5) died within 15 dpi, resulting in high pathogenic fraction (2.6 and 2.9); foxes showed relatively mild CD symptoms and died within 21 DPI in 40% (2/5) with moderate pathogenic fraction (2.15 and 2.25). In addition, IFN-gamma and IL-4 were down-regulated and up-regulated at the mRNA transcription level in dead and surviving animals, respectively. TNF-_transcription level was up-regulated in the pathogenic animals, indicating that there was a correlation between CDV pathogenicity and cytokine changes. In this study, the CDV-H gene sequences of 16 minks, foxes and minks from Shandong, Hebei, Liaoning and Heilongjiang provinces in China from 2011 to 2013 were analyzed. Compared with the prevalent strains of CDV before 2012, 10 strains of CDV-H protein from Shandong Province and the binding region (RBS) of SLAM receptor occurred in I542N. Y549H and Y549H mutations, which are independent of the genotype of Asia-1 in phylogenetic trees, are named CDV variants (HI542N/Y549H). Three-dimensional structural analysis shows that Y549H mutation alters the intermolecular interaction between H protein and mink SLAM (mSLAM), and I542N mutation results in a potential N-linked glycosylation site at 542-544 of H protein. Population evolution analysis of CDV-H gene revealed that the mutant strain originated from fur animals in China in 2006. The Y549H mutation was affected by selection pressure during the evolution of H gene. The outbreak of the mutant strain may indicate that the CDV is more adaptable to fur animals under host or immune pressure. Based on the animal pathogenic model of CDV established by us, the animal infections of CDV variants SD (14) 7 and classical strain LN10 (1) 1 were tested. The results showed that the CDV variants were toxic (fever, mortality and pathological changes, etc.) to fur animals (especially minks) and induced immunosuppression (lymphopenia, suppression of neutralizing antibodies). The level of CDV-H gene 542 and 549 amino acid mutation, CDV-H protein and mSLAM immunoprecipitation and cell fusion test, protein expression in H, receptor affinity and cell infection were carried out. The results showed that: (1) I542N mutation did not cause H protein to be glycosylated at this site; (2) I542N and Y549H mutations decreased H protein expression but enhanced the interaction between H protein and mSLAM. (3) I542N and Y549H mutations did not enhance the effect of CDV-H/F protein on mSLAM-expressing cells. In conclusion, the frequent outbreaks of CDs in fur animals in China in recent years may be due to the emergence of highly virulent CDV mutants, which preliminarily reveals the molecular mechanism of increased pathogenicity of CDV mutants to fur animals, especially minks.
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.92

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