【摘要】：肌肉嫩度是影響肉質品質的重要因素,目前豬的育種工作將提高肌肉嫩度作為重要育種目標之一。然而作為肌肉嫩度重要的候選基因Prdx6和Prdx2影響嫩度的分子機制尚不清楚。本文主要研究這兩個基因的轉錄調控,以及對肌肉、脂肪細胞分化的影響,從而探索其中的分子機制。主要的研究結果如下:(1)分析了豬Prdx6基因組織表達譜,通過5′RACE確定了豬Prdx6基因的轉錄起始位點,位于翻譯起始位點上游65bp處的腺嘌呤位點,將該位點定義為+1。(2)克隆了豬Prdx6基因的5′端上游調控序列1684bp,利用生物信息學方法預測豬Prdx6啟動子區(qū),發(fā)現(xiàn)有很多轉錄因子結合,并且近端有4個GC-box。對得分較高的肌肉脂肪發(fā)育相關轉錄因子C/EBPβ、MyoD、CREB及GC-box上的Sp1結合位點進行多序列比對發(fā)現(xiàn)序列在不同物種中的保守性也很高。通過6段缺失載體的構建,轉染三種真核細胞,確定了啟動子的主要活性區(qū)域,然后通過該活性區(qū)域4段缺失載體的進一步構建,轉染細胞,確定了該基因轉錄活性的最小單元為HSF結合位點。(3)將轉錄因子C/EBPβ、MyoD、CREB、Sp1和HSF1與相應的啟動子載體共轉染,確定了這些轉錄因子均能提高Prdx6啟動子活性,并通過定點突變實驗進行驗證。超表達各個轉錄因子后采用定量和Western的方法驗證轉錄因子和目的基因的表達量,確定了C/EBPβ和CREB能夠促進Prdx6基因表達,干涉C/EBPβ和CREB可使Prdx6基因表達量下降。采用EMSA和ChIP實驗驗證了C/EBPβ和CREB能夠結合到Prdx6基因的啟動子區(qū)相應的轉錄因子結合位點。通過免疫沉淀實驗發(fā)現(xiàn)轉錄因子C/EBPβ與Prdx6在蛋白水平互作,而CREB與Prdx6不存在互作關系。(4)分析了豬Prdx2基因組織表達譜,通過5′RACE確定了豬Prdx2基因的轉錄起始位點,位于ATG翻譯起始位點上游70bp處的鳥嘌呤位點。克隆了豬Prdx2基因的5′端上游調控區(qū)域共計2360bp,通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)有許多轉錄因子結合位點,并存在TATA框和GC-box。通過9段缺失載體的構建,轉染三種真核細胞,確定了啟動子的主要活性區(qū)域,然后通過該活性區(qū)域4段缺失載體的進一步構建,轉染細胞,確定了該基因的核心區(qū)域為TATA框。(5)通過定量的方法分析Prdx6和Prdx2基因在肌肉和脂肪細胞分化過程中的表達情況,確定了這兩個基因與肌肉脂肪細胞的分化有關。采用定量和Western的方法驗證了超表達和干涉Prdx6基因后對C2C12細胞分化標志基因的影響。(6)檢測了C2C12細胞分化不同時期細胞內(nèi)活性氧的含量發(fā)現(xiàn)ROS水平隨細胞分化而逐漸升高。體外添加抗氧化劑NAC可以降低細胞分化中產(chǎn)生的ROS。通過超表達使內(nèi)源抗氧化物Prdx6水平升高也可以降低ROS含量,干涉使細胞內(nèi)Prdx6水平降低會使細胞ROS水平升高。本研究分析了嫩度候選基因Prdx6和Prdx2的基礎轉錄調控機制,提出Prdx6基因通過與C/EBPβ互作或通過調控活性氧水平參與調控脂肪或肌肉發(fā)育的分子機制,為進一步研究這兩個基因在肌肉脂肪發(fā)育過程中的作用提供理論基礎。
[Abstract]:Muscle tenderness is an important factor affecting the quality of meat quality. At present, pig breeding will improve muscle tenderness as one of the important breeding targets. However, as a candidate gene, Prdx6 and Prdx2, an important candidate for muscle tenderness, the molecular mechanism of tenderness is not clear. This paper mainly studies the transcription regulation of these two bases, and the muscle and fat thin. The molecular mechanism of cell differentiation was explored. The main results were as follows: (1) the tissue expression profiles of porcine Prdx6 gene were analyzed, and the transcriptional starting site of the pig Prdx6 gene was determined by 5 'RACE, and the adenine site at the upstream of the translation start site was located, and the site was defined as +1. (2) cloned the 5' end of the pig Prdx6 gene. The upstream regulatory sequence 1684bp, using bioinformatics to predict the pig Prdx6 promoter region, found a number of transcription factors binding, and 4 GC-box. near the proximal end of the muscle fat development related transcription factor C/EBP beta, MyoD, CREB, and GC-box Sp1 binding sites were found to have multiple sequence alignment in different species. Through the construction of 6 deletion vectors, three eukaryotic cells were transfected to determine the main active region of the promoter, and then through the further construction of the 4 segment deletion vector of the active region, the transfected cells were transfected, and the minimum unit of the transcriptional activity was determined to be HSF binding site. (3) the transcription factor C/EBP beta, MyoD, CREB, Sp1 and HSF1 Co transfection with the corresponding promoter, determined that these transcription factors could improve the activity of Prdx6 promoter and verified by site directed mutagenesis. After overexpression of various transcription factors, quantitative and Western methods were used to verify the expression of transcription factors and target genes, and that C/EBP beta and CREB could promote the expression of Prdx6 genes. The interference of C/EBP beta and CREB could decrease the expression of Prdx6 gene. The EMSA and ChIP experiments showed that C/EBP beta and CREB could bind to the corresponding transcription factor binding site of the promoter region of the Prdx6 gene. The interaction of the transcription factor C/EBP beta and Prdx6 at the protein level was found by the immunoprecipitation experiment, while CREB was not interacted with Prdx6. (4) analysis. The expression profile of porcine Prdx2 gene was determined by 5 'RACE, and the transcriptional starting site of the pig Prdx2 gene was located at the guanine loci in the upstream of the ATG translation start site. A total of the upstream regulation region of the 5' terminal of the pig Prdx2 gene was cloned, and a number of transcription factor binding sites were found by bioinformatics analysis, and the TATA frame was found. And GC-box. transfection of three eukaryotic cells through the construction of 9 deletion vectors, determined the main active region of the promoter, and then transfected cells through the further construction of the 4 segment deletion vector of the active region, and determined the core region of the gene as TATA frame. (5) the Prdx6 and Prdx2 genes were analyzed by quantitative method in muscle and fat cells by quantitative method. In the process of differentiation, the two genes were determined to be related to the differentiation of muscle fat cells. Quantitative and Western methods were used to verify the effect of overexpression and interference of Prdx6 gene on the differentiation marker genes of C2C12 cells. (6) the content of reactive oxygen species in cells of different stages of differentiation of C2C12 cells was detected and the ROS level was found with the cells. The addition of antioxidant NAC in vitro can reduce the ROS. produced in cell differentiation through overexpression and increase the level of endogenous antioxidant Prdx6 and reduce ROS content. Interference causes the decrease of Prdx6 level in cells to increase the level of cell ROS. This study analyzed the basic transcriptional modulation of the candidate gene for tenderness, Prdx6 and Prdx2. Control mechanisms suggest that Prdx6 gene provides a theoretical basis for further study of the role of these two genes in the development of muscle fat by interacting with C/EBP beta or by regulating reactive oxygen species (ROS) and regulating the molecular mechanisms of fat or muscle development.
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S828

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本文編號：2131488