發(fā)布時間：2018-07-16 18:01

【摘要】：保幼激素(juvenile hormone, JH)除了在昆蟲幼蟲階段拈抗蛻皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)的作用而決定昆蟲蛻皮或變態(tài)之外,它還在許多昆蟲的成蟲羽化后起促進生殖的作用,但對JH促進生殖的的分子機制仍缺乏了解。飛蝗(Locusta migratoria)是世界性的重要農(nóng)業(yè)害蟲,有很強的繁殖能力。不同于果蠅、伊蚊、家蠶、赤擬谷盜等研究對象的生殖由JH和20E共同調(diào)控,飛蝗的卵黃發(fā)生、卵巢發(fā)育和卵成熟則由JH調(diào)控。因此,飛蝗也是研究JH調(diào)控昆蟲生殖分子機制的一個理想模式。飛蝗的卵巢屬于無滋式(panoistic),即卵小管沒有滋養(yǎng)細胞或滋養(yǎng)絲,卵成熟所需的卵黃原蛋白(vitellogenin, Vg)等由脂肪體合成,通過血淋巴和卵泡細胞的胞間隙運送到成熟過程中的卵母細胞。早期的研究發(fā)現(xiàn),飛蝗羽化后到產(chǎn)卵前的第一個促性腺周期內(nèi),脂肪體和卵泡細胞進行內(nèi)分裂(endocycle),形成高達16倍體的多倍性(polyploidy)細胞,為飛蝗生殖發(fā)育所必需,也受JH調(diào)節(jié),但不清楚其中的分子調(diào)控機制。為了解碼JH調(diào)控飛蝗生殖的分子機制,課題組通過RNA-seq方法獲取了JH缺失和JH誘導脂肪體的差異基因表達譜。KEGG通路分析表明,DNA復制和細胞周期信號通路分別位列第一和第四。QRT-PCR驗證了DNA復制通路的16個基因和細胞周期通路中的13個基因都在JH誘導下顯著上調(diào)。本論文首先選擇在DNA復制中起核心作用的6個復制解旋酶基因(Mcm2-7)開展進一步的研究。對JH受體Met基因進行RNAi后,發(fā)現(xiàn)Mcm3、Mcm4和Mcm7表達水平顯著下降。對Mcm4和Mcm7的啟動子區(qū)域進行序列分析,分別鑒定到Met結(jié)合的E-box-like和E-box元件。熒光素酶報告和電泳遷移實驗均證明JH受體復合體(Met/SRC)可以結(jié)合Mcm4和Mcm7上游的E-box或E-box-like序列,直接調(diào)控Mcm4和Mcm7的轉(zhuǎn)錄。通過RNAi沉默Mcm4或Mcm7,脂肪體細胞的DNA復制和細胞多倍化嚴重受阻,Vg表達大幅度下調(diào),卵巢發(fā)育和卵母細胞成熟受到顯著抑制,表型與JH缺失和Met RNAi相似。這些研究結(jié)果表明,Mcm4和Mcm7在JH調(diào)控的飛蝗生殖發(fā)育中發(fā)揮重要作用,JH通過其受體復合體Met/SRC直接調(diào)控Mcm4和Mcm7的表達,影響細胞的DNA復制和多倍化,進而調(diào)節(jié)卵黃生成、卵巢發(fā)育和卵母細胞成熟。Mcm2-7加載到DNA復制起點形成復制前體依賴于Cdc6,而Cdc6在JH誘導的差異基因表達譜中也顯著上調(diào)。鑒于Cdc6在DNA復制和細胞周期檢控中的重要作用,本論文也對Cdc6在JH調(diào)節(jié)的飛蝗生殖發(fā)育中的功能和調(diào)控機理進行了研究。QRT-PCR結(jié)果顯示,Cdc6的表達不但受JH誘導上調(diào),也在MetRNAi后顯著下調(diào)。對Cdc6基因上游的DNA序列進行克隆和分析,在啟動子區(qū)域-1063到-1058處發(fā)現(xiàn)一個E-box-like元件。利用飛蝗脂肪體和果蠅S2細胞進行電泳遷移實驗都證明Met可以結(jié)合Cdc6啟動子區(qū)域含E-box-like元件的20bpDNA序列。熒光素酶報告實驗表明,JH/Met/SRC直接調(diào)控Cdc6的轉(zhuǎn)錄。Cdc6RNAi和流式細胞實驗顯示,Cdc6缺失不但顯著降低脂肪體細胞和卵泡細胞的倍性,也導致這些組織的細胞分裂；同時,Vg表達、卵巢發(fā)育和卵母細胞成熟都受到非常顯著的抑制；而且,上述表型缺陷在JH處理后并不能恢復到正常水平。這些研究結(jié)果表明,Cdc6參與JH調(diào)節(jié)的飛蝗細胞多倍化和生殖發(fā)育,在JH誘導下,Cdc6與Mcm4、Mcm7協(xié)同提高DNA復制和細胞的倍性,可能增加包括Vg在內(nèi)的所有基因的拷貝數(shù),進而促進Vg的大量合成,同步滿足所有首卵的成熟。此外,本論文還對調(diào)控細胞內(nèi)分裂的E2f1開展了初步研究。E2fl RNAi造成脂肪體細胞和卵泡細胞的雙核或多核化,并顯著降低細胞的倍性。與Cdc6、Mcm4或Mcm 7 RNAi相似,E2f1 RNAi后飛蝗的Vg表達、卵巢發(fā)育和卵母細胞成熟也受到顯著抑制。論文的初步研究結(jié)果表明,E2f1在JH調(diào)控的飛蝗細胞多倍化過程中也發(fā)揮著非常重要的作用。以后對E2f1的進一步研究將會闡明JH怎樣調(diào)控E2fl的表達,E2f1如何作用于飛蝗細胞的內(nèi)分裂和多倍化。綜合上述研究結(jié)果,特別是對JH通過Met/SRC直接調(diào)控Mcm4、Mcm7和Cdc6的表達,提高脂肪體細胞和卵泡細胞的多倍化,進而促進Vg的大量合成和卵成熟的解析,揭示了JH促進昆蟲生殖的一個重要機制。
[Abstract]:In order to decode the molecular mechanism of insect reproduction , it has been found that it is an ideal model to regulate the reproductive development of migratory locust . The expression of Cdc6 was not only up - regulated but also down - regulated after MetRNAi . The DNA sequence upstream of Cdc6 gene was cloned and analyzed .
At the same time , Vg expression , ovarian development and oocyte maturation were significantly inhibited ;
The results showed that the expression of E2f1 , Mcm7 and Mcm7 could increase the number of double - binucleate or multilateralization of the cells . The results showed that E2f1 could regulate the expression of E2fl , increase the multifold of the fat cells and the follicle cells , and then promote the large - scale synthesis of Vg and the analysis of the maturation of eggs , and reveal the important mechanism of promoting the reproduction of insect .
【學位授予單位】：中國科學技術(shù)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S433.2

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本文編號：2127185