本文選題：柑橘　切入點(diǎn)：分子標(biāo)記　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：柑橘是世界第一大果樹,栽培歷史悠久,其鮮果和果汁具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而,柑橘育種面臨著極大的挑戰(zhàn),如大多數(shù)重要性狀為復(fù)雜的數(shù)量性狀、世代周期長、遺傳背景復(fù)雜、無融合生殖和配子體不育現(xiàn)象普遍等。利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳圖譜的構(gòu)建和QTL定位研究,能找到與育種目標(biāo)性狀緊密連鎖的或共分離的標(biāo)記,利用分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)可極大的縮短育種年限、提高育種定向性和效率。本研究首先基于克里曼丁橘的全基因組序列開發(fā)了大量的共顯性SSR標(biāo)記,并且基于枳基因組重測序數(shù)據(jù)大規(guī)模的開發(fā)了可靠的Indel標(biāo)記,為柑橘的進(jìn)一步遺傳研究提供了寶貴的資源;然后以克里曼丁橘和枳為親本進(jìn)行雜交,構(gòu)建了F1分離群體,利用SSR標(biāo)記、Indel標(biāo)記和結(jié)合簡化基因組測序技術(shù)開發(fā)的SNP標(biāo)記,構(gòu)建了柑橘的高密度遺傳連鎖圖譜;最后對(duì)后代落葉分離表型進(jìn)行QTL定位分析,首次分析了控制枳落葉性狀的QTL位點(diǎn)。主要研究結(jié)果如下:1.從數(shù)據(jù)庫中獲得克里曼丁橘全基因組信息,通過MISA軟件共找到80,708個(gè)SSR位點(diǎn),平均密度為268個(gè)/Mb,二核苷酸和三核苷酸基序重復(fù)類型最多。對(duì)33,929個(gè)轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)6,834個(gè)轉(zhuǎn)錄本序列共包含8,989個(gè)SSR位點(diǎn),然后對(duì)這些轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了功能注釋和不同基序重復(fù)類型進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。2.利用獲得的SSR位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記開發(fā),設(shè)計(jì)了105對(duì)引物(27個(gè)SSR位于genomic和78個(gè)位于CDs區(qū)域)。對(duì)柑橘三大屬的18個(gè)不同種進(jìn)行鑒定,獲得95個(gè)穩(wěn)定性好、多態(tài)性高的SSR標(biāo)記(成功的標(biāo)記占比為90.5%)。進(jìn)一步聚類分析表明,18個(gè)柑橘種聚為三大類,各種間聚類結(jié)果與前期的研究報(bào)道相一致。3.對(duì)克里曼丁橘和枳的雜交后代(CP)和枳(PT)進(jìn)行了基因組深度重測序(測序深度分別為22.86 X和25.98 X)。通過比對(duì),CP中得到了2,591,103個(gè)SNP位點(diǎn),PT中獲得了3,105,640個(gè)SNP位點(diǎn),共同的SNP位點(diǎn)有503,132個(gè)。此外,CP中得到了722,298個(gè)Indel位點(diǎn),PT中獲得了895,643個(gè)Indel位點(diǎn),CP與PT共有的Indel位點(diǎn)有157,471個(gè)。4.隨機(jī)篩選了82個(gè)Indel位點(diǎn)并在其兩端設(shè)計(jì)引物,對(duì)柑橘三屬的32份不同種進(jìn)行鑒定,最終獲得了74個(gè)穩(wěn)定性好、有多態(tài)性的Indel標(biāo)記(去掉無效擴(kuò)增和無多態(tài)性的標(biāo)記)。進(jìn)一步聚類分析表明,各種間聚類分析結(jié)果與前人的研究報(bào)道相一致。結(jié)果表明,基于枳基因組深度重測序開發(fā)的Indel標(biāo)記效率(90.24%)和可靠性均較高。5.利用SSR和Indel標(biāo)記并結(jié)合簡化基因組測序技術(shù)開發(fā)的SNP標(biāo)記,分別構(gòu)建了雙親的高密度遺傳連鎖圖譜,以及雙親整合的遺傳圖譜。其中,母本遺傳圖譜共包含1,491個(gè)標(biāo)記,總圖距為1773.53 c M,平均圖距為1.19 c M;父本遺傳圖譜共包含2,980個(gè)標(biāo)記,總圖距為1530.88 c M,平均圖距為0.51 c M;而雙親整合后的遺傳圖譜共包含4,179個(gè)標(biāo)記,總圖距為1770.37 c M,平均圖距為0.42c M。SNP標(biāo)記統(tǒng)計(jì)表明,偏分離標(biāo)記所占總標(biāo)記的比例相比于前期的研究稍微偏高;對(duì)物理圖譜和遺傳圖譜共線性分析表明構(gòu)建圖譜質(zhì)量較高,并發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)明顯的重組熱點(diǎn)區(qū)域。6.對(duì)后代落葉分離表型進(jìn)行了觀察,獲得了兩年的表型數(shù)據(jù),結(jié)合構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜,進(jìn)行落葉性狀的QTL定位。再次,利用Mutmap方法定位了染色體1和8上兩個(gè)區(qū)間,區(qū)間大小分別為1.37 Mb和0.67 Mb,并且分別包含36個(gè)和107個(gè)基因。其中,染色體8上定位區(qū)間更加顯著,具有更大的基因密度。7.對(duì)2個(gè)定位區(qū)間的共143個(gè)候選基因組進(jìn)行了功能注釋,并在貢獻(xiàn)值較大的染色體8上定位區(qū)間驗(yàn)證了幾個(gè)與表型連鎖的Indel標(biāo)記,并進(jìn)一步縮小了染色體8上的關(guān)聯(lián)區(qū)間范圍。由于枳的落葉性與冬季低溫關(guān)系密切,本研究進(jìn)一步對(duì)枳幼苗進(jìn)行低溫處理,根據(jù)功能注釋和前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),在染色體1和8定位區(qū)間內(nèi)分別篩選了7和23個(gè)候選基因,并利用q RT-PCR驗(yàn)證了候選基因在低溫誘導(dǎo)下的表達(dá)模式。結(jié)果表明,12個(gè)基因受低溫脅迫誘導(dǎo)后表達(dá)顯著升高,2個(gè)基因下調(diào)表達(dá)顯著,而剩余的16個(gè)基因表達(dá)變化不明顯,這些結(jié)果為進(jìn)一步獲得落葉關(guān)聯(lián)基因奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Is the world's largest citrus fruit, has a long history of cultivation, its fruit and fruit juice has important economic value. However, citrus breeding is facing great challenges, such as the most important traits for complex quantitative traits, the generation of a long cycle, complex genetic background, apomixis and gametophyte sterility phenomenon. Research on construction and QTL the positioning of genetic map by using molecular marker technology, can be found closely linked with breeding target traits or co segregating marker assisted selection, breeding technology can greatly shorten the breeding period using molecular markers, improve breeding orientation and efficiency. Based on the complete genome sequence of the orange Clementina developed codominant SSR marker number the orange, and genome sequencing data based on the large-scale development of Indel markers and reliable, and provide a valuable resource for further genetic studies of citrus; Then to Clementina orange and trifoliate orange parent for hybridization, construct the F1 segregating populations using SSR markers, Indel markers and SNP markers with simplified genome sequencing technology development of the citrus high density genetic linkage map was constructed; finally the offspring phenotype was QTL leaves separation analysis, is analyzed for the first time locus QTL control trifoliate leaf traits the main results are as follows: 1. from the database to obtain information through the whole genome of orange Clementina, MISA found a total of 80708 SSR loci, the average density is 268 /Mb, dinucleotide and trinucleotide repeat motifs. On most types of sequences of 33929 transcriptome analysis, found that 6834 transcripts sequence consists of 8989 SSR site, then these transcripts were annotated and different motifs repeat type statistics.2. marker development using SSR gene was designed. 105 pairs of primers (27 SSR in genomic and 78 in CDs region). Identification of 18 species of Citrus three genera and 95 SSR markers with good stability, high polymorphism (successful markers accounted for 90.5%). Further cluster analysis showed that 18 species were clustered into three categories, research reports and previous clustering results between consistent progeny.3. of trifoliate orange and Clementina (CP) and orange (PT) of genome sequencing (depth of sequencing depth were 22.86 X and 25.98 X). By comparison, the CP received 2591103 SNP loci, obtained 3105640 SNP loci PT, SNP loci in the 503132. In addition, CP received 722298 Indel loci, 895643 Indel loci were obtained in PT, CP and PT shared Indel loci with 157471.4. randomly selected 82 Indel sites and at two ends of the primers of Citrus three genera 32 A different species were identified, got 74 good stability, there are polymorphic Indel markers (remove invalid amplified polymorphism and no further). Cluster analysis showed that consistent between cluster analysis results and previous reports. The results showed that the orange gene Indel labeling efficiency re sequencing depth development group based on (90.24%) and higher reliability.5. using SSR and Indel markers and SNP markers to simplify the genome sequencing technology development, were constructed by the parents of high density genetic linkage map, genetic mapping and integration. The parents, maternal genetic map contains 1491 markers, a total distance of 1773.53 C M, average the map is 1.19 C M; paternal genetic map contains 2980 markers, a total distance of 1530.88 C M, the average map distance of 0.51 C M; and the parents after the integration of the genetic map contains 4179 markers, a total distance of 1770.37 C M, the average map distance of M.SNP markers showed that 0.42c statistics, skewed markers of total markers compared with previous studies on the physical map and slightly higher; genetic map linear analysis showed that the mapping of higher quality, and found several obvious recombination hotspots of.6. were observed on the offspring leaves separation phenotype. The phenotypic data of two years, with the construction of the genetic linkage map and localization of QTL were deciduous traits. Thirdly, using Mutmap method to locate the chromosome 1 and 8 on the two interval, interval sizes were 1.37 Mb and 0.67 Mb, and contains 36 and 107 genes, respectively. Among them, the positioning interval on chromosome 8 more significantly, with greater density of.7. gene were 143 candidate genome of 2 positioning interval of functional annotation, and larger values of chromosome 8 was verified with several positioning interval in phenotypic contribution The Indel markers, and further reduced on chromosome 8 associated range. Due to low temperature in winter and deciduous Poncirus closely, the further study of Poncirus trifoliata seedlings were treated with low temperature, according to the transcriptome data and functional annotation of the 7 and 23 candidate genes were screened in chromosome 1 and 8 positioning area in between, and the use of Q RT-PCR to verify the expression patterns of candidate genes induced by low temperature stress. The results showed that 12 genes induced by low temperature stress was significantly higher, 2 genes downregulated significantly, while the remaining 16 genes expression did not change significantly, these results laid the foundation for further defoliation associated genes.

【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S666

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本文編號(hào)：1610772