本文選題：銨態(tài)氮　切入點(diǎn)：硝態(tài)氮　出處：《華南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：硝態(tài)氮(NO3-)和銨態(tài)氮(NH4+)是植物吸收的兩種主要氮源,二者對植物細(xì)胞氧化還原狀態(tài)、光合作用、水分吸收、礦質(zhì)養(yǎng)分吸收及代謝等生理生化過程都有著不同的效應(yīng)。研究表明,對于許多蔬菜作物而言,適當(dāng)比例的銨硝態(tài)氮混合營養(yǎng)比單一氮源更能促進(jìn)植物的生長和對氮素的吸收,并能提高氮素利用效率。但目前對于NH4+在氮素吸收過程中是否存在調(diào)控作用及其分子機(jī)制還不十分清楚。菜心(Brassica campestris L.ssp.chinensis var.Utilis Tsen et Lee),又名菜薹,為十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種中的一個(gè)變種,以幼嫩薹莖和葉片兩部分為主要食用器官,是華南地區(qū)栽培面積和產(chǎn)量都最大的特產(chǎn)蔬菜,現(xiàn)在全國各地均有栽培。菜心喜硝,在水培條件下以吸收硝態(tài)氮為主,極易積累硝酸鹽。本論文從NH4+對菜心氮素吸收的調(diào)控作用,菜心銨離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因AMT1對不同氮素供應(yīng)的響應(yīng)特性以及不同銨硝比下菜心根系表達(dá)譜分析等幾個(gè)方面在分子水平上探究銨態(tài)氮對菜心根系吸收氮素的分子調(diào)控機(jī)制,主要結(jié)果如下:1.NH4+對菜心生長和根系吸收氮素的調(diào)控作用在等氮水平下設(shè)不同銨硝配比處理(0:100,5:95,25:75,50:50)以及等硝水平下增施不同濃度NH4+(0 m M、0.5 m M、1 m M和2 m M)處理,結(jié)果表明,與全硝營養(yǎng)相比,菜心在銨硝比為5:95和25:75以及增施0.5 m M和1 m M NH4+處理中的生物量均顯著提高,但NH4+占總氮比例達(dá)50%時(shí),菜心根系和地上部的生長均受到顯著抑制。在4 m M NO3-營養(yǎng)的基礎(chǔ)上施加微量NH4+(0.1m M)也能顯著提高菜心地上部的生物量,同時(shí)還顯著促進(jìn)了根系對氮素的吸收,提高了植株的總氮積累量。2.菜心銨離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Bc AMT的克隆及其基本表達(dá)特性分析克隆得到了菜心Bc AMT1;1、Bc AMT1;3、Bc AMT1;4和Bc AMT1;5基因的c DNA全長序列,經(jīng)過序列分析和蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測推測它們均是跨膜蛋白,與細(xì)菌銨離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Amt B有相似的結(jié)構(gòu)區(qū)域。洋蔥表皮亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明,四個(gè)基因均定位于細(xì)胞膜上,而酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明4個(gè)菜心Bc AMT蛋白均具能使缺陷型酵母31019b在NH4+單一氮源培養(yǎng)基上恢復(fù)生長,這表明4個(gè)Bc AMT1s蛋白均有NH4+轉(zhuǎn)運(yùn)活性。Bc AMT1;1、Bc AMT1;3和Bc AMT1;5均在根系中表達(dá)量最高,而Bc AMT1;4則在根系中不表達(dá),只在葉片和花朵中有表達(dá)。Bc AMT1;1、Bc AMT1;3和Bc AMT1;5在根系中的表達(dá)均存在晝夜節(jié)律,Bc AMT1;1的表達(dá)受光抑制,而Bc AMT1;3和Bc AMT1;5則在高光強(qiáng)下表達(dá)上調(diào)。3.根系Bc AMT1s基因?qū)Σ煌吹捻憫?yīng)特性利用q RT-PCR技術(shù)對相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行相對定量分析,利用15N同位素示蹤法分析根系對NH4+的吸收速率。結(jié)果表明,缺氮處理均促進(jìn)了Bc AMT1;1、Bc AMT1;3和Bc AMT1;5在根系的表達(dá),同時(shí)提高了根系對NH4+的吸收能力�；謴�(fù)供應(yīng)NO3-后Bc AMT1;1和Bc AMT1;5的表達(dá)均顯著下調(diào),而Bc AMT1;3的表達(dá)變化不大。結(jié)合外源供應(yīng)單一NH4+對菜心根系Bc AMT1s基因的濃度響應(yīng)曲線(圖3.3)和時(shí)間響應(yīng)曲線(圖3.4)來看,總體來講,Bc AMT1;1和Bc AMT1;5的表達(dá)在短時(shí)間內(nèi)受NH4+的誘導(dǎo),長時(shí)間高濃度NH4+處理后則表達(dá)下調(diào),而Bc AMT1;3則對外源NH4+很敏感,無論菜心植株處于何種氮營養(yǎng)水平下,低濃度或高濃度NH4+處理均短時(shí)間內(nèi)就顯著抑制其表達(dá)。此外,不同濃度NH4+處理2 h均使菜心根系對NH4+的吸收能力顯著降低。與全硝營養(yǎng)相比,短時(shí)間(48 h)內(nèi)混合銨硝態(tài)氮處理均顯著抑制了菜心Bc AMT1s基因的表達(dá),而不同銨硝比氮源長期(10 d以上)處理實(shí)驗(yàn)中,與全硝營養(yǎng)相比,根系Bc AMT1;1、Bc AMT1;3和Bc AMT1;5均是在低NH4+處理下表達(dá)水平最高,當(dāng)NH4+濃度達(dá)1 m M以上時(shí)表達(dá)均受到抑制。4.菜心根系吸收法瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的建立半定量PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果均表明本研究成功建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菜心根系吸收法瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),并對轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明,不經(jīng)過高滲處理的菜心植株以O(shè)D600=0.3的菌液靜置浸染3-9 h可取得較高的轉(zhuǎn)化效率,目的基因在根系的超表達(dá)可持續(xù)2-4 d,在轉(zhuǎn)化后第6 d,目的基因表達(dá)水平開始下降。5.Bc AMT1;3對Bc AMT和Bc NRT基因表達(dá)及根系吸收氮素能力的調(diào)控瞬時(shí)超表達(dá)菜心根系Bc AMT1;3顯著促進(jìn)了Bc AMT1;1和Bc AMT1;5以及Bc NRT1;1和Bc NRT2;1在根系的表達(dá)均顯著上調(diào),同時(shí)顯著提高了菜心根系對NH4+和NO3-的吸收;反之,抑制菜心根系Bc AMT1;3的表達(dá)使Bc AMT1;1、Bc NRT1;1和Bc NRT2;1的表達(dá)均顯著降低,但菜心根系對NH4+和NO3-的吸收無顯著差異。6.不同銨硝配比下,菜心根系轉(zhuǎn)錄組分析利用RNA-Seq技術(shù)首次獲得了菜心的轉(zhuǎn)錄組信息,包含53746條unigene序列,其中78.61%的序列在公共數(shù)據(jù)庫得到了注釋。同時(shí),對不同銨硝配比(CK:0/100,T1:5/95,T2:25/75,T3:50/50)處理15 d后的菜心根系作了表達(dá)譜分析,結(jié)果共2242個(gè)unigene差異表達(dá),共覆蓋了97個(gè)KEGG代謝通路,其中有13個(gè)顯著富集通路,主要包括光合相關(guān)代謝途徑,植物激素信號傳導(dǎo)途徑和氮素代謝途徑,等。此外,在菜心根系轉(zhuǎn)錄中還鑒定了2913個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,其中189個(gè)在4個(gè)氮素處理間表現(xiàn)出了表達(dá)差異。綜上所述,NH4+不僅是作為營養(yǎng)物質(zhì)還很可能作為信號分子調(diào)控菜心生長和氮素吸收,且Bc AMT1;3很可能參與了菜心NH4+調(diào)控途徑,正向調(diào)控Bc AMT1;1和Bc AMT1;5以及Bc NRT1;1和Bc NRT2;1在根系的表達(dá)以及菜心根系對NH4+和NO3-的吸收,而激素信號途徑相關(guān)基因及轉(zhuǎn)錄因子也廣泛參與了根系氮素吸收及代謝調(diào)控。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S634.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1607618