發(fā)布時(shí)間：2018-03-07 05:30

  本文選題：番茄黃化曲葉病毒　切入點(diǎn)：水楊酸　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：番茄黃化曲葉病毒病(Tomato yellow leaf curl disease,TYLCD)由番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)引起,嚴(yán)重威脅番茄安全生產(chǎn)。目前番茄抗TYLCV研究主要通過將野生材料中抗性基因、標(biāo)記滲透到栽培品種中,或者通過RNAi(RNA interference)技術(shù)干擾病毒基因序列以達(dá)到抑制病毒基因組復(fù)制的目的。前者耗時(shí)長(zhǎng),抗性不穩(wěn)定,后者涉及到轉(zhuǎn)基因技術(shù),目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)還沒有被消費(fèi)者廣泛接受。誘導(dǎo)植物抗性為我們提供了一條新思路。誘導(dǎo)抗性是指植物在一些非生物或生物激發(fā)子刺激下,對(duì)隨后病原的侵染產(chǎn)生更快更強(qiáng)的防御反應(yīng)。植物誘導(dǎo)抗性主要包括兩種:一種是誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得性抗性(ISR),另外一種是系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)。ISR抗性途徑依賴于茉莉酸(JA)和乙烯(ET)信號(hào)。SAR可以通過前期病原侵染,也可以通過化學(xué)物質(zhì),如水楊酸(SA)或水楊酸衍生物苯丙噻二唑(BTH)誘導(dǎo)植物SAR的發(fā)生。因此,我們提出通過SA提高番茄對(duì)TYLCV誘導(dǎo)抗性的思路。誘導(dǎo)抗性需要MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)系統(tǒng)參與,而植物抗病毒需要RNAi信號(hào)參與;MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)、RNAi在SA介導(dǎo)抗性中到底發(fā)揮什么作用。本試驗(yàn)通過外源葉面噴施SA,檢測(cè)番茄植株TYLCV抗性指標(biāo),確定SA誘導(dǎo)番茄植株的最適濃度;然后通過最適SA濃度研究RNAi通路關(guān)鍵基因SlDCL2和SlDCL4以及誘導(dǎo)抗性關(guān)鍵基因MAPK3在番茄抗TYLCV防御中的作用,進(jìn)一步研究它們與SA信號(hào)的關(guān)系,對(duì)SA誘導(dǎo)抗性在抗TYLCV的作用機(jī)理做了一定研究,為植物誘導(dǎo)抗性抗病毒提供理論依據(jù)。主要結(jié)果如下:(1)外源葉面噴施SA提高番茄植株對(duì)TYLCV耐性的最適濃度為0.5mM。用不同濃度的SA前處理感病材料‘TTI112B-2’,2天后人工接種TYLCV侵染性克隆,一個(gè)月后統(tǒng)計(jì)發(fā)病率(%)和發(fā)病指數(shù)。結(jié)果顯示0.5mM SA前處理植株的發(fā)病率(51.1%)和發(fā)病指數(shù)(29.3)顯著低于對(duì)照(68.8%,35.7),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)RNAi通路相關(guān)基因被誘導(dǎo)表達(dá),TYLCV對(duì)植物細(xì)胞膜的破壞降低,植物抗氧化能力提高、光合能力增強(qiáng),植物葉片中病毒的相對(duì)含量降低,植株病癥減緩,經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)性抗性被誘導(dǎo)。(2)DCL2和DCL4在番茄抗TYLCV防御方面至關(guān)重要。利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)25個(gè)RNAi通路基因在抗感材料‘Y19’和‘TTI112B-2’中的差異,結(jié)果顯示:在抗感病材料中,大多數(shù)RNAi相關(guān)基因都可以被TYLCV誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),但是抗性材料中表達(dá)相對(duì)較高。通過VIGS技術(shù)沉默SlDCL2和SlDCL4,發(fā)現(xiàn)抗性材料TYLCV含量增加,病情指數(shù)增加,抗性被破壞,而感病材料提前發(fā)病,TYLCV含量同樣增加。(3)SA誘導(dǎo)植物對(duì)TYLCV抗性需要DCL2和DCL4參與。用0.1mMSA前處理擬南芥dcl2,dcl4和dcl2/4突變體,24h后人工接種TYLCV,14天后qPCR、ELISA和半定量檢測(cè)TYLCV含量。結(jié)果顯示SA前處理可以抑制野生型擬南芥Col-中TYLCV的復(fù)制,但是不能夠降低dcl2、dcl4和dcl2/4突變中的病毒含量。(4)MAPK3參與調(diào)控番茄植株對(duì)TYLCV的耐性。TYLCV接種抗性番茄材料‘Y19’,qPCR、ELISA以及Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示SlMAPK3參與番茄植株的抗TYLCV響應(yīng)。通過VIGS和植物過表達(dá)技術(shù)證明MAPK3參與調(diào)控SA、JA防御信號(hào)通路基因的SlPR1/SlPR2,SlLapA/SlPI-I/SlPI-II表達(dá),提高了番茄植株的抗氧化能力,最終提高了植株對(duì)TYLCV的耐性。(5)SA信號(hào)參與TYLCV病原誘導(dǎo)的MAPK3響應(yīng)。用0.1 mM SA前處理SA信號(hào)中斷突變體npr1,24 h后,人工接種接種TYLCV,12 h后,Western blot檢測(cè)MAPK3活性,結(jié)果顯示野生型Col-中TYLCV誘導(dǎo)的MAPK3磷酸化增幅大于npr1中的。0.1mMSA前處理不能抑制mapk3中TYLCV的復(fù)制,但是可以降低野生型Col-中的TYLCV含量。
[Abstract]:TYLCD (Tomato yellow leaf curl disease, TYLCD) by tomato yellow leaf curl virus (Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) caused a serious threat of tomato production safety. Current research of TYLCV resistance is mainly through resistance of wild materials in gene markers penetrated into cultivars, or through the RNAi (RNA interference) interference virus gene sequence to inhibit the replication of the virus genome. The purpose of the former is time-consuming, the resistance is not stable, which relates to transgenic technology, transgenic technology has not been widely accepted by consumer. Plant resistance provides a new idea for us. The induced resistance refers to the plants in some non biological or biological elicitor stimulation, defense faster and stronger on the infection of the pathogen. The plant induced resistance mainly includes two types: one is the induction of acquired resistance system (ISR), another is the systemic acquired resistance (SAR) resistant.ISR pathway dependent on jasmonic acid (JA) and ethylene (ET) signal.SAR through early pathogen infection can also, by chemical substances, such as salicylic acid or salicylic acid derivatives (SA) phenyl thiophene (BTH) two were induced by plant SAR. Therefore, we propose to improve the induced resistance of tomato TYLCV way through SA. MAPK signal cascade induced resistance system in plant antiviral RNAi signals in MAPK; cascade signal, RNAi in the end what is the role of SA mediated resistance. In this experiment, exogenous foliar SA, detection of tomato plants TYLCV resistance index sure, the optimum concentration of SA in tomato plants; then the optimum SA concentration of RNAi pathway key genes SlDCL2 and SlDCL4 and induced resistance genes in the MAPK3 anti TYLCV defense role in tomato, further study The relationship with SA signal, do some research on SA induced resistance in the mechanism of anti TYLCV, and provide a theoretical basis for plant induced resistance to antiviral. The main results are as follows: (1) exogenous spraying SA increased tomato plant tolerance to TYLCV the optimal concentration of 0.5mM. with different concentrations of SA before treatment of susceptible materials "TTI112B-2 ', 2 days after the inoculation of TYLCV infectious clone, incidence rate after one month (%) and disease index. The results showed that 0.5mM SA before the onset of treatment plant rate (51.1%) and disease index (29.3) was significantly lower than the control (68.8%, 35.7), further study found that RNAi signaling pathway related genes were induced to express TYLCV, reduce the damage to the plant cell membrane, improve the antioxidant capacity of plant photosynthetic capacity, reduce the relative virus content in leaves of plants, plant disease resistance by slow detection system is induced. (2) DCL2 and DCL4 in tomato TYL It is very important for CV defense. Using qRT-PCR technology to detect 25 genes of the RNAi pathway in resistant and susceptible materials' Y19 'and' TTI112B-2 'differences, results showed that: in the resistant and susceptible materials, most of the RNAi genes can be induced by upregulation of the expression of TYLCV, but the expression of resistance material is relatively high. Through the VIGS technology to silence SlDCL2 and SlDCL4, TYLCV content was found to increase the resistance of materials, the disease index increased, the resistance was destroyed, while the susceptible materials early onset, the content of TYLCV also increased. (3) SA induced plant resistance to TYLCV DCL2 and participation in DCL4. With the Arabidopsis dcl2 treatment before 0.1mMSA, DCL4 and dcl2/4 mutants, 24h after inoculation TYLCV 14 after qPCR, ELISA and semi quantitative detection of TYLCV content. The results showed that TYLCV can inhibit Col- replication in wild type Arabidopsis SA before treatment, but can not reduce the content of dcl2, DCL4 and dcl2/4 mutations in the virus (4. MAPK3) is involved in the regulation of tomato plants to TYLCV tolerance.TYLCV inoculated resistant tomato materials' Y19 ', qPCR, ELISA and Westernblot showed that the anti TYLCV response of SlMAPK3 in tomato plants. Plant expression by VIGS and that MAPK3 is involved in the regulation of SA signal pathway, JA defense gene SlPR1/SlPR2, SlLapA/SlPI-I/SlPI-II expression increased in tomato plant antioxidant ability, and ultimately improve the tolerance of plants to TYLCV. (5) SA signal in TYLCV pathogen induced MAPK3 response. By 0.1 mM SA pretreatment SA signal interruption mutant npr1,24 h after artificial inoculation with TYLCV, 12 h, Western blot MAPK3 activity assay, the results showed that TYLCV induced phosphorylation of MAPK3 growth of wild type Col- in more than NPR1 in.0.1mMSA pretreatment could not inhibit mapk3 TYLCV replication, but can reduce the content of TYLCV of wild type Col-.

【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S436.412

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本文編號(hào)：1578149