發(fā)布時間：2018-02-22 16:34

  本文關(guān)鍵詞： ZNF33B SNP 卵丘細(xì)胞 卵母細(xì)胞成熟 基因表達(dá)調(diào)控　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：鋅指蛋白廣泛存在于真核及原核生物中,作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,通過選擇性的與特異靶結(jié)構(gòu)結(jié)合,在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、配子功能、胚胎發(fā)育等生命活動中發(fā)揮著重要的作用。牛鋅指蛋白33B(ZNF33B)基因全長35440bp,c DNA全長1358bp,編碼一個由137氨基酸組成的蛋白。因其含有krüppel相關(guān)性保守盒的C2H2型鋅指蛋白,也稱KRAB型鋅指蛋白。ZNF33B基因廣泛存在于各個器官組織中,目前對ZNF33B基因功能的研究較少,尤其在卵巢中,僅有少量文獻(xiàn)表明ZNF33B基因的表達(dá)量在實施超數(shù)排卵的卵巢內(nèi)卵丘細(xì)胞中有顯著改變,但其具體表達(dá)規(guī)律、對卵巢組織與卵母細(xì)胞成熟的作用及功能尚不明確。本研究首先發(fā)現(xiàn)牛ZNF33B基因5'UTR存在g.-61GT突變,等位基因G、T的基因頻率分別為0.3489和0.6511,三種基因型AA、AB、BB頻率分別為0.1007、0.4964和0.4029。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn),BB型個體在超排后總卵數(shù)、可用胚胎數(shù)、退化胚胎數(shù)及未受精卵數(shù)都顯著或極顯著高于AA型個體(P0.05或P0.01),AB型個體超排性狀位于前兩者之間。同時,在ZNF33B第一內(nèi)含子也存在一段124bp的插入序列,在所測群體中的插入率為12.95%,但存在該段插入序列的牛個體在所分析的超排性狀上與未插入組比較并無顯著差異(P0.05)。基于上述研究結(jié)果,為明確ZNF33B基因在卵巢組織中的表達(dá)規(guī)律,本研究首先通過QRT-PCR、Western Blot、免疫組化及免疫熒光等方法,對ZNF33B在牛卵巢中的表達(dá)情況進(jìn)行了進(jìn)一步研究。結(jié)果顯示,ZNF33B在卵泡期卵巢皮質(zhì)及髓質(zhì)中的表達(dá)量高于黃體期卵巢皮質(zhì);而在不同發(fā)育時期黃體中,ZNF33B的表達(dá)由血體期-分泌黃體期-白體期呈逐漸下降趨勢;ZNF33B主要分布于各級卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞的胞質(zhì)及顆粒黃體細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),在卵巢基質(zhì)、卵丘細(xì)胞胞質(zhì)、膜黃體細(xì)胞胞質(zhì)均有分布,但表達(dá)量低于卵母細(xì)胞及顆粒黃體細(xì)胞胞質(zhì)。而卵母細(xì)胞在通過體外培養(yǎng)成熟后分別進(jìn)行孤雌激活和體外受精形成的早期胚胎中,ZNF33B主要分布于早期胚胎各卵裂球的細(xì)胞核中。基于ZNF33B基因在卵巢組織內(nèi)具有差異表達(dá)且對卵母細(xì)胞成熟具有潛在作用的可能,本研究進(jìn)一步對其在卵丘細(xì)胞生長發(fā)育及卵母細(xì)胞成熟中的作用進(jìn)行了深入研究。本研究首先通過QRT-PCR發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞成熟后卵丘及卵母細(xì)胞的ZNF33B的表達(dá)極顯著升高(P0.01),然后通過RNAi技術(shù)敲減ZNF33B基因在原代培養(yǎng)的卵丘細(xì)胞中的表達(dá),卵丘細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析顯示低表達(dá)ZNF33B基因的卵丘細(xì)胞早期凋亡率顯著高于對照組(P0.05),晚期凋亡率和細(xì)胞凋亡總率極顯著高于對照組(P0.01),表明低表達(dá)的ZNF33B促進(jìn)卵丘細(xì)胞的凋亡。隨后,為進(jìn)一步探討ZNF33B在卵母細(xì)胞成熟過程中的作用和具體機(jī)制,本研究采用顯微注射方法先將si RNA注入GV期卵母細(xì)胞胞質(zhì)中,進(jìn)行體外培養(yǎng)和成熟,通過觀察第一極體排出情況及相關(guān)功能基因的表達(dá)明確ZNF33B對卵母細(xì)胞成熟的影響。結(jié)果顯示注射組卵母細(xì)胞成熟率極顯著低于對照組(P0.01);而對卵母細(xì)胞成熟具有重要作用的Cdc25C、PDE3A、CCNB1和RBBP4表達(dá)水平顯著或極顯著降低(P0.05或P0.01),而EGFR和RBL2表達(dá)無顯著變化(P0.05)。綜上所述,ZNF33B基因多態(tài)性對牛超數(shù)排卵性狀具有重要影響,可作為牛超數(shù)排卵性狀分子標(biāo)記并應(yīng)用于早期選種、選育。ZNF33B在卵巢組織中的表達(dá)具有時空特異性,可影響卵丘細(xì)胞生長發(fā)育并可調(diào)控特定細(xì)胞因子的表達(dá)影響卵母細(xì)胞成熟,本研究從基因水平及蛋白水平明確了ZNF33B基因影響卵母細(xì)胞成熟的作用,不僅為深入解析鋅指蛋白分子調(diào)控通路及其作用以及卵母細(xì)胞成熟的機(jī)制提供了理論基礎(chǔ),還為提高雌性動物繁殖力及早期選種選育提供了新依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S828

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本文編號：1524806