本文關(guān)鍵詞： 泌乳奶牛 低質(zhì)粗料 多組學(xué) 跨器官 系統(tǒng)生物學(xué) 代謝機(jī)制 調(diào)控策略　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：牛奶是人類重要的蛋白食品來源,利用人類不可食用作物副產(chǎn)品生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牛奶是一個(gè)全球性的課題。本研究通過基于多組學(xué)的系統(tǒng)生物方法,深入解析了不同質(zhì)量粗飼料影響奶牛泌乳性能的生理和代謝機(jī)制。在明確飼喂玉米秸對(duì)奶牛泌乳性能及表觀代謝參數(shù)影響的基礎(chǔ)上,運(yùn)用代謝組學(xué)、宏基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等分別從四種體液的代謝組、瘤胃微生物代謝的分子機(jī)制、肝臟和乳腺關(guān)鍵代謝功能差異進(jìn)行系統(tǒng)探究;運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)結(jié)果并結(jié)合營養(yǎng)學(xué)原理制定日糧調(diào)控策略,使飼喂含玉米秸日糧奶牛的生產(chǎn)性能達(dá)到飼喂苜蓿草奶牛同樣水平,產(chǎn)生了顯著的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益。1.玉米秸稈日糧對(duì)奶牛生產(chǎn)性能及表觀代謝參數(shù)的影響本部分以苜蓿干草為主要粗料源的日糧為對(duì)照,研究了玉米秸為主要粗料日糧對(duì)奶牛產(chǎn)奶量、乳成分、瘤胃發(fā)酵參數(shù)及血液生化指標(biāo)的影響。試驗(yàn)選取健康無病的經(jīng)產(chǎn)中國荷斯坦奶牛16頭(產(chǎn)奶量=29.4±2.16kg/d;泌乳天數(shù)=164±27.5d),隨機(jī)分為兩組,每組8頭。兩組日糧采用等氮非等能設(shè)計(jì),精粗比均為55:45(DM基礎(chǔ)),但粗飼料來源不同(DM):(1)23%苜蓿干草+7%中國羊草(AH);(2)30%玉米秸稈(CS)。結(jié)果顯示,兩組間干物質(zhì)采食量沒有顯著差異(P=0.43);飼喂CS日糧奶牛的產(chǎn)奶量、飼料轉(zhuǎn)化率極顯著低于飼喂AH日糧奶牛(P0.01),乳蛋白含量(P = 0.04)和乳糖含量(P = 0.02)也顯著低于AH組。CS組瘤胃總VFA中乙酸、丙酸含量分別極顯著高于和低于AH組(P0.01),其乙酸丙酸比極顯著高于AH組(P0.01);血液葡萄糖濃度CS組顯著低于AH(P = 0.03)。這說明相對(duì)于AH日糧,飼喂CS日糧奶牛泌乳性能低下,瘤胃中丙酸含量較低,乙酸含量較高,血糖濃度低下。2.玉米秸稈日糧影響奶牛泌乳能的生理和代謝機(jī)制本部分應(yīng)用代謝組學(xué)、宏基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)及不同組學(xué)之間的關(guān)聯(lián)分析,系統(tǒng)研究了奶牛多體液跨器官的關(guān)鍵功能和代謝通路,闡明了 CS組奶牛生產(chǎn)性能低下的分子機(jī)制。2.1基于四種體液的奶牛機(jī)體系統(tǒng)代謝機(jī)理于試驗(yàn)期第65天晨飼前采集16頭奶牛的瘤胃液、血清、牛奶和尿液樣品,通過基于氣相色譜-飛行時(shí)間檢測器串聯(lián)質(zhì)譜儀(GC-TOF/MS)的代謝組學(xué)技術(shù)檢測四種體液中的代謝物質(zhì)。在瘤胃液、血清、牛奶和尿液中分別解析出165、218、195和156種代謝物質(zhì),其中有29種為四體液共有代謝物質(zhì)�；诠灿形镔|(zhì)的顯著相關(guān)通路為甘氨酸-絲氨酸-色氨酸代謝、甘油脂代謝、苯丙氨酸代謝和酪氨酸代謝通路(P0.05Impact valud0.1)。瘤胃液、血清、牛奶和尿液中分別鑒定得到55,28,8和31種顯著差異代謝物質(zhì)(VIP1P0.05),對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵代謝通路為絲氨酸-色氨酸代謝,酪氨酸代謝和苯丙氨酸代謝。對(duì)8頭AH組奶牛四種體液的代謝組進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),肌酸是區(qū)分四組體液代謝差異的關(guān)鍵物質(zhì)(FDR0.01,VIP= 1.537),富集最顯著的通路包括糖異生通路、丙酮酸代謝、三羧酸循環(huán)、甘油酯代謝和天冬氨酸代謝(FoldEnrichment2,FDR0.05)。代謝組學(xué)分析顯示,兩處理組間最大的差異是氨基酸代謝通路,最富集的通路與碳水化合物代謝有關(guān)。2.2宏基因組-代謝組研究奶牛瘤胃代謝的分子機(jī)制選用同樣16頭牛瘤胃內(nèi)容物,提取DNA,利用IllulluminaMiSeq進(jìn)行2x300bp雙向測序。利用宏基因組學(xué)快速注釋或子系統(tǒng)技術(shù)(MG-RAST)分析平臺(tái)解析瘤胃微生物多樣性及其功能。共檢測到古菌、細(xì)菌和真核生物計(jì)60個(gè)門,784個(gè)屬和3560種的微生物。細(xì)菌門水平上,CS組中Proteobacteria、Fibrobacteres和Lentisphaerae的相對(duì)豐度顯著高于AH組(P0.05);在細(xì)菌屬水平上,CS 組中 Bacteroides,Parabacteroides,Porphyromoas,Paludibacter,Fibrobacter和Victivallis的相對(duì)豐度顯著高于AH組(P0.05),而Treponema和Succinimonas顯著低于AH組(P0.05)。細(xì)菌種水平上(相對(duì)豐度 ≥ 0.01%),僅在 AH 組中發(fā)現(xiàn) T.maltophilum,而 T.sacccharophilum 和 T.succinifaciens在CS組中顯著較低(P0.05)。微生物功能方面,只有碳水化合物代謝功能在CS組顯著下調(diào)(P=0.028),包括乳酸還原酶、Ⅰ型谷氨酰胺合成酶、甲基丙二酸單酰CoA脫羧酶、琥珀酸脫氫酶和a-木糖苷ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(P0.05)。通過關(guān)鍵微生物宏基因組元件與CS組顯著下調(diào)的微生物代謝物質(zhì)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),Fibrobacter和11種代謝物質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)(R-0.5,P0.05),甲基丙二酸單酰CoA脫羧酶編碼基因和3種代謝物質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)(R-0.5,P0.05),琥珀酸脫氫酶與14種代謝物質(zhì)呈強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系(R0.5,P0.05)。在CS日糧下,較低水平的NFC成分(果膠,果糖和巖藻糖等)引起微生物豐度和碳水化合物相關(guān)功能下調(diào),導(dǎo)致17種中間代謝產(chǎn)物顯著降低,同時(shí)減弱了琥珀酸通路功能,顯著減少了丙酸生成。CS組高含量的乙酸與高水平的Fibrobacter屬細(xì)菌、以及甲基丙二酸單酰CoA脫羧酶功能上調(diào)密切相關(guān)。2.3代謝組-轉(zhuǎn)錄組研究奶牛肝臟關(guān)鍵代謝功能差異本研究從每組8頭奶牛中選擇6頭,分別利用GC-TOF/MS和Illumina HiSeq2000測定肝臟組織中的代謝產(chǎn)物和基因表達(dá)圖譜。共解析到515個(gè)有效峰,其中有270種代謝產(chǎn)物,兩組間存在28種差異代謝物質(zhì)(VIP1P0.05),其中CS組有15種代謝物質(zhì)顯著下調(diào),13種代謝物質(zhì)顯著上調(diào)。根據(jù)獨(dú)創(chuàng)通路分析(IPA)結(jié)果,在肝臟中共鑒定得到11條顯著不同的功能通路(P0.01,|z-score|2),差異最大的功能通路為氨基酸代謝通路和糖異生通路(P0.001,z-score-2)。參與氨基酸代謝的代謝物質(zhì)通路拓?fù)鋱D顯示,甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸代謝是兩組日糧中差異最大,富集程度最高的通路(P =0.029,Impactvalue = 0.597)。亮氨酸、胱氨酸和馬尿酸作為差異代謝表征物可以代表兩組間99.9%的差異�；赗NA-Seq在肝臟組織中共鑒定得到11371個(gè)基因,利用基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)得到18個(gè)不同基因模塊,通過對(duì)代謝表征物和基因模塊的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),糖異生功能、丙酮酸代謝、單糖生物合成過程、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、己糖生物合成是在CS組顯著下調(diào)的基因功能。轉(zhuǎn)錄組-代謝組整合分析顯示肝臟中最關(guān)鍵的功能差異來自CS組糖異生通路豐度和功能均顯著下調(diào),伴隨了多種中間代謝產(chǎn)物和編碼關(guān)鍵酶的基因相對(duì)豐度較低,這很可能是CS組瘤胃中丙酸含量顯著降低造成,而這也影響了到乳腺組織的葡萄糖供應(yīng)。2.4代謝組-轉(zhuǎn)錄組研究奶牛乳腺關(guān)鍵代謝功能差異利用上述同樣的奶牛,分析了奶牛乳腺組織關(guān)鍵代謝功能的差異。共解析到493個(gè)有效峰,其中有273種代謝產(chǎn)物,兩組間共9種差異代謝物質(zhì)(VIP1P0.05),其中有3種代謝物質(zhì)在CS組顯著下調(diào),6種代謝物質(zhì)在CS組顯著上調(diào)。在CS組所有顯著下調(diào)的功能通路中,差異最大的為氨基酸攝取、L-氨基酸攝取、碳水化合物代謝和葡萄糖-6磷酸氧化(P0.001,z-score-2)。表征物組合(馬來酸、連苯三酚和琥珀酸)可以預(yù)測兩組間乳腺組織99.6%的代謝差異�；赗NA-Seq在乳腺組織中檢測鑒定得到10174個(gè)基因。代謝表征物-基因共表達(dá)模塊關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示,鈣離子綁定、乙�；�、分泌及膜流動(dòng)性等相關(guān)基因功能在CS組下調(diào)。上述結(jié)果表明,CS組乳腺葡萄糖供應(yīng)不足及乳糖合成相關(guān)功能下調(diào)造成了乳腺乳糖合成量減少,從而引起奶產(chǎn)量下降;CS組血中氨基酸含量下降及乳腺氨基酸攝取、利用、分泌及膜功能的下調(diào),共同造成了乳蛋白低下。3.基于多組學(xué)結(jié)果的營養(yǎng)調(diào)控研究在系統(tǒng)梳理了多組學(xué)試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,本部分結(jié)合營養(yǎng)學(xué)知識(shí)并考慮經(jīng)濟(jì)和環(huán)境因素制定了基于玉米秸稈日糧的優(yōu)化方案。選取日產(chǎn)奶量27kg左右的健康無病的經(jīng)產(chǎn)中國荷斯坦奶牛39頭,隨機(jī)分為3組,每組13頭,第一、二組試驗(yàn)日糧同前期試驗(yàn)一致,分別飼喂CS和AH,第三組采用優(yōu)化日糧(CSM):保留23%玉米秸稈,增加苜蓿干草(7%)和可溶性糖粉(4.8%甘蔗糖蜜),降低玉米使用量(3.9%)和麥麩使用量(5%),補(bǔ)充了氨基酸(41.4g/d賴氨酸鹽酸鹽+14.1 g/d蛋氨酸),調(diào)整餅粕組成使三個(gè)日糧的粗蛋白水平一致。CSM組的泌乳凈能高于CS組(1.52vs.1.45Mcal/kgDM),但低于AH組(1.57Mcal/kgDM)。整個(gè)試驗(yàn)期持續(xù)監(jiān)測產(chǎn)奶量,共記錄1404次產(chǎn)奶量(3次/周/牛),每周測定一次乳成分。結(jié)果顯示,CSM組奶牛的平均產(chǎn)奶量極顯著高于CS組(P0.0001),與AH組中沒有差異(P=0.435)。CSM組乳蛋白含量極顯著高于CS組(P=0.008),與AH組也無顯著差異(P=0.946)。同樣地,乳糖含量在CSM中極顯著高于CS組(P=0.0006)但與AH組無差異(P=0.308)。上述結(jié)果說明,利用多組學(xué)研究結(jié)果并結(jié)合營養(yǎng)學(xué)理論制定調(diào)控策略,可有效利用玉米秸稈等農(nóng)副產(chǎn)品資源,不僅可大幅降低生產(chǎn)成本,而且也具有顯著的環(huán)境效益。綜上所述,橫跨瘤胃液、血清、牛奶和尿液四種體液及瘤胃、肝臟和乳腺三器官的代謝組、宏基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究,揭示了飼喂玉米秸稈奶牛乳產(chǎn)量相關(guān)的生理和代謝機(jī)制,為更好利用人類不可食用作物副產(chǎn)品生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牛奶提供了重要的基礎(chǔ)知識(shí)和實(shí)踐應(yīng)用啟示。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S823.5
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本文編號(hào)：1444027