本文關(guān)鍵詞：茶樹育性相關(guān)基因的克隆與表達研究　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：茶樹是一種廣泛種植的經(jīng)濟作物,由于自交不親和、雜交結(jié)實率低和品種間雜交結(jié)實率差異大,導(dǎo)致茶樹遺傳背景復(fù)雜、雜交育種效率低,限制了遺傳學(xué)研究和遺傳改良相關(guān)工作的開展。本研究以茶樹自交不親和機制為切入點,使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法,發(fā)掘茶樹育性相關(guān)基因,對關(guān)鍵基因進行克隆,并通過基因分型、基因表達和蛋白的原核表達等手段,研究關(guān)鍵基因在茶樹育性分子機制中的作用。本研究主要結(jié)果如下:1.使用熒光顯微鏡觀察自交(‘福鼎大白茶’ב福鼎大白茶’)和異交(‘福鼎大白茶’ב中茶108’)授粉花柱中花粉管的生長差異。發(fā)現(xiàn)授粉24 h~48 h自交花粉管的生長速度明顯慢于異交花粉管;授粉72 h,異交和自交花粉管均長至花柱基部。表明自交花粉管在花柱中的生長受到了一定程度的抑制,到達花柱基部的時間有明顯延遲。2.為了明確自交花粉管生長受抑的分子機制,本文使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法研究了茶樹自交(self-pollination,SP)和異交(cross-pollination,CP)授粉24 h、48 h和72 h后花柱中基因表達的差異。獨立構(gòu)建6個轉(zhuǎn)錄組測序文庫(CP24、CP48、CP72、SP24、SP48和SP72)分別進行測序,共得到了63762個Unigene。通過比較SP和CP樣本間的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選到大量的差異表達基因,其中包括Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞凋亡、植物-病原菌互作和活性氧代謝等過程相關(guān)的基因,為茶樹育性相關(guān)重要基因的篩選奠定了基礎(chǔ)。然后研究了SP和CP樣本中隨授粉時間變化的基因表達規(guī)律,發(fā)現(xiàn)花柱對自花和異花花粉管具有完全不同的響應(yīng)模式,其中83個參與氧化還原過程基因的上調(diào)表達在SP樣本中有明顯的延遲,與自交花粉管生長受抑的表型一致,推測這些基因可能直接參與了花粉管生長的調(diào)控。3.對自交和異交授粉的茶樹子房進行了轉(zhuǎn)錄組測序,拼接得到51200個Unigene。與根、葉片和花柱的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比較,篩選到99個在茶樹子房中特異表達的基因,這些基因在花粉-雌蕊互作、花粉管引導(dǎo)和雙受精過程中具有重要功能。使用熒光定量PCR的方法,研究了51個與IAA、乙烯、ABA和GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)Unigene,在SP和CP授粉子房中的表達規(guī)律,篩選到6個表達規(guī)律具有顯著差異的Unigene,分別為:GID1、SAUR、GH3.6、GH3.1、IAA29和ARF1,這些基因可能在茶樹花粉管-子房互作階段具有重要功能。4.S-RNase基因是配子體型自交不親和機制(gametophytic self-incompatibility,GSI)中的雌性決定因子。本研究從轉(zhuǎn)錄組差異表達基因中,篩選并克隆了一個Cs S-RNase基因(KU852488),該基因全長1121 bp,開放閱讀框全長717 bp,編碼283個氨基酸殘基;該基因主要在花柱中表達;自交授粉花柱中Cs S-RNase的上調(diào)表達明顯早于異交花柱,且授粉24 h自交花柱中表達量顯著高于異交花柱,與自花花粉管受抑時間一致。檢測該基因在11個茶樹品種(系)中的基因型,發(fā)現(xiàn)該基因存在豐富的遺傳多態(tài)性。然后將Cs S-RNase定位到了實驗室構(gòu)建的遺傳圖譜上。對Cs S-RNase基因進行原核表達,成功分離到了目標(biāo)蛋白。使用不同Cs S-RNase蛋白濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)花粉,發(fā)現(xiàn)Cs S-RNase能夠明顯抑制自花花粉管的生長。以上結(jié)果表明Cs SRNase符合GSI植物S-RNase基因的典型特征,認為茶樹自交不親和性在分子機制上受GSI機制控制。5.從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到14個具有完整開放閱讀框的鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases,CDPKs)基因。使用熒光定量PCR檢測CDPKs的組織表達特異性,發(fā)現(xiàn)5個Cs CDPKs基因在花粉中特異表達。然后克隆了這5個Cs CDPKs的c DNA全長序列。同源比對發(fā)現(xiàn),它們與多個擬南芥中參與花粉管極性生長的CDPKs有較高的同源性。5個Cs CDPKs隨著花粉培養(yǎng)時間的延長,表達量呈上升趨勢,其中Cs CPK3、Cs CPK4和Cs CPK5在花粉培養(yǎng)初始階段便有快速響應(yīng)。進一步選擇了Cs CPK5設(shè)計并合成了硫代修飾的反義寡核苷酸鏈,對該基因在茶樹花粉管中的表達進行特異性的沉默,發(fā)現(xiàn)能夠抑制花粉管的生長,因此Cs CPK5在茶樹花粉管的生長過程中具有重要的功能。
[Abstract]:In order to clarify the molecular mechanism of pollen tube growth , it was found that the growth rate of selfing pollen tube was obviously slower than that of pollen tube . The results showed that the growth rate of selfing pollen tube was obviously slower than that of pollen tube . The expression of Cs S - RNase gene in pollen tube - ovary was studied by fluorescence quantitative PCR . The results showed that the expression of Cs S - RNase was significantly higher than that in the pollen tube . The specific silencing of the expression of the gene in the pollen tube of the tea tree shows that the growth of the pollen tube can be inhibited , so that the Cs CP5 can play an important function in the growth process of the tea tree pollen tube .

【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S571.1

【參考文獻】

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本文編號：1434653