本文關鍵詞：內質網(wǎng)應激在銅差異性影響黃顙魚和蝦虎魚脂代謝中的作用及其機制　出處：《華中農業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：內質網(wǎng)(Endoplasmic reticulum,ER)是一個擔負重要生理功能的細胞器,不僅擔負著蛋白質正常的合成折疊和運輸,而且還承擔著甘油三酯和膽固醇的合成以及細胞內鈣離子的儲存。當細胞受到體內外的刺激時,內質網(wǎng)中將出現(xiàn)未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的積聚,從而導致內質網(wǎng)發(fā)生不同程度的內質網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulum stress,ER Stress),并激活其下游信號通路——未折疊蛋白反應(Unfolded protein response,UPR)。近年來,人們對ER Stress及其介導的信號通路的剖析已經取得了重要進展,發(fā)現(xiàn)了一些關鍵基因和蛋白,也查明了信號通路;同時,最近研究也表明ER Stress及其介導的信號通路在脂類代謝中發(fā)揮了重要作用。然而,這些研究大都是在陸生哺乳動物開展的,有關魚類中ER Stress及其介導的信號通路知之甚少。銅是魚類必需的微量元素之一,作為多種酶的輔助因子及一些蛋白的組成部分,廣泛參與魚體內的生理生化過程。我們前期研究已經表明銅(經由水體和/或飼料途徑)可對魚類脂肪沉積及代謝產生影響。然而,目前我們實驗室連同國際上一些其他的實驗的工作仍局限于銅影響下與魚類脂類代謝直接相關酶活性及基因表達的變化情況。對于銅元素影響脂類代謝上游調控通路的情況認識較少�？紤]到ER Stress及其介導的信號通路在脂類代謝中扮演重要角色,我們推斷ER Stress及其介導的信號通路在銅差異性影響不同魚類脂代謝過程中同樣發(fā)揮著重要的作用。然而,迄今為止,在魚類中有關此類研究仍未見報道。本研究以黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)和蝦虎魚(Synechogobius hasta)為研究對象,首先克隆得到了一些內質網(wǎng)應激基因的c DNA全長序列,并在此基礎上進一步探討了ER Stress及其介導的信號通路在銅差異性影響這兩種魚脂代謝過程中的作用及機制,主要分為以下3個部分內容:第一部分:黃顙魚和蝦虎魚內質網(wǎng)應激基因的分子克隆及組織表達分析利用簡并引物,采用RACE技術分別從黃顙魚和蝦虎魚中獲得了5條ER Stress相關基因的c DNA全長序列,包括葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)、鈣網(wǎng)蛋白(CRT)、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶(PERK)、跨膜蛋白激酶(IRE)-1α和真核翻譯起始因子(ATF)-6α。其中,在黃顙魚中,該5種基因全長序列分別為2544 bp、1678 bp、3776 bp、3440 bp和2785 bp,分別編碼652、418、1080、1038和657個氨基酸;在蝦虎魚中,該5種基因全長序列分別為2477 bp、1953 bp、4050 bp、4095bp和2845 bp,分別編碼652、419、1106、1027和645個氨基酸。同源性分析的結果顯示,在黃顙魚中,這五種基因與斑馬魚(Danio rerio)、青溕(Oryzias latipe)、人(Homo sapiens)及爪蟾(Xenopus tropicalis)等其他物種的氨基酸同源性為40.4% 94.9%;在蝦虎魚中,這5種ER Stress相關基因與斑馬魚(Danio rerio)、小鼠(Rattus norvegicus)、人(Homo sapiens)及爪蟾(Xenopus tropicalis)等其他物種的氨基酸同源性為41.5% 97.8%。進化樹分析結果進一步證明了黃顙魚和蝦虎魚的進化地位。預測其蛋白結構的結果表明,該5種ER Stress基因在黃顙魚和蝦虎魚中均包含如KDEL基序、信號肽序列、傳感器域和效應者結構域等結構域。通過熒光實時定量PCR技術,研究了黃顙魚和蝦虎魚GRP78、CRT、PERK、IRE-1α及ATF-6α在不同組織中的基因表達水平。結果顯示,這5種ER Stress基因在黃顙魚和蝦虎魚所有被檢測組織中均有表達,且均在肝臟組織中有較高的表達量。第二部分:銅對黃顙魚和蝦虎魚內質網(wǎng)應激及其介導的信號通路的影響2.1.水體銅暴露對黃顙魚內質網(wǎng)應激及其介導的信號通路的影響本實驗是在銅離子濃度分別為對照、30μg Cu/L和60μg Cu/L的水體中對黃顙魚進行的暴露實驗,并分別于28天和56天取肝臟組織進行分析,研究水體銅暴露對黃顙魚肝臟內內質網(wǎng)超微結構、ER Stress及其介導的信號通路的影響。結果顯示,在28天時,GRP78、GRP94、CRT、PERK、e IF2α、IRE-1α和XBP-1基因的m RNA表達水平有所升高。而在58天時,隨著水體銅濃度的上升,GRP78、GRP94、CRT、PERK、e IF2α、IRE-1α、XBP-1和ATF-6α基因的表達水平則有所下降,表明水體銅暴露誘導黃顙魚肝臟內產生了ER Stress反應,且該現(xiàn)象具有時間依賴性效應;同時,也表明水體銅暴露激活了兩條UPR通路,既PERK e IF2α和IRE1 XBP1通路。黃顙魚肝臟細胞內的內質網(wǎng)超微結構也進一步證實了上述結論。ER是細胞內最大的鈣庫,ER Stress與鈣離子(Ca2+)有著不可分割的關系,細胞內Ca2+濃度失調是ER Stress眾多的表面形式之一。因此,為探究銅誘導黃顙魚肝細胞產生ER Stress所通過的細胞內鈣動員通路,本實驗利用熒光探針Fluo-4/AM結合激光共聚焦顯微鏡技術測定了黃顙魚肝細胞內鈣離子濃度。結果顯示,銅孵育顯著增加了肝細胞內鈣離子的濃度。同時,通過添加內質網(wǎng)膜上鈣通道的特異性拮抗劑(IP3特異性抑制劑2-APB和Ry R特異性抑制劑(dantrolene),我們的結果顯示銅離子通過動員釋放內質網(wǎng)中的鈣離子,而造成細胞質中鈣離子濃度的快速升高,表明細胞中鈣離子穩(wěn)態(tài)的失衡是銅誘導產生ER Stress反應的重要原因。2.2.飼料銅缺乏和過量對黃顙魚內質網(wǎng)應激及其介導的信號通路的影響為了研究飼料銅缺乏和過量對黃顙魚肝臟和肌肉組織中ER Stress及其介導的信號通路的影響及其機理,黃顙魚分別飼喂三種不同銅水平(銅缺乏(0.76 mg/kg)、適量銅(4.18 mg/kg)和銅過量(92.45 mg/kg))的飼料8周。結果顯示,在肝臟組織中,銅過量顯著上調了GRP78、CRT、PERK、e IF2α、IRE-1α和XBP-1基因的表達水平;但銅缺乏只上調了CRT的m RNA表達水平。在肌肉組織中,銅過量顯著地上調了GRP78、CRT和XBP-1基因的表達水平,而對其他基因的表達水平沒有顯著影響。銅缺乏對所有檢測基因的表達水平均沒有顯著影響。因此,本實驗表明飼料銅過量可以引起黃顙魚體內的ER Stress反應,并激活了PERK e IF2α和IRE1 XBP1通路,且該現(xiàn)象呈現(xiàn)組織特異性。2.3.水體銅暴露對蝦虎魚內質網(wǎng)應激及其介導的信號通路的影響在本研究中,蝦虎魚分別暴露于對照、18μg Cu/L、38μg Cu/L和55μg Cu/L四種不同銅離子濃度的水體中,并分別于30天和60天取肝臟組織進行分析,研究水體銅暴露對蝦虎魚ER Stress及其介導的信號通路的影響。結果顯示,在30天時,水體銅暴露顯著提高了兩種ER Stress相關標志物(GRP78和CRT)及UPR信號途徑中幾種關鍵基因(PERK、e IF2α、IRE-1α、XBP-1和ATF-6α)的表達量,表明水體銅暴露誘導蝦虎魚肝臟組織內發(fā)生了ER Stress反應,并進一步激活了UPR信號通路。在60天時,GRP78、CRT、PERK、e IF2α、IRE-1α、XBP-1和ATF-6α基因的m RNA水平在18μg Cu/L和38μg Cu/L暴露組中有所上升。而在55μg Cu/L暴露組中,這些ER Stress基因的表達水平則有所下降,此結果與在30天時觀察到的結果正好相反,表明水體銅暴露在蝦虎魚肝臟內誘導的ER Stress反應及UPR信號通路的激活具有時間和濃度依賴性效應。同樣,為探究銅誘導蝦虎魚肝細胞產生ER Stress所通過的細胞內鈣動員的通路,我們探究了銅孵育對蝦虎魚肝細胞內質網(wǎng)鈣離子穩(wěn)態(tài)的影響。結果表明銅孵育可以引起蝦虎魚肝細胞細胞質內鈣離子濃度的升高。內質網(wǎng)膜上鈣離子通路特異性抑制劑的添加,查明了內質網(wǎng)中鈣離子的流失是銅誘導細胞質中鈣離子升高的原因,同時也表明鈣離子穩(wěn)態(tài)的失衡在銅離子誘導的ER Stress反應的重要原因。第三部分:內質網(wǎng)應激及其介導的信號通路在銅影響黃顙魚和蝦虎魚脂肪沉積及脂代謝中的作用及其機制3.1.內質網(wǎng)應激及其介導的信號通路在銅影響黃顙魚脂肪沉積及SREBP-1c活化過程中的作用及部分機制首先,本實驗將黃顙魚分別暴露于三種銅濃度(對照、30μg Cu/L和60μg Cu/L)的水體中,并分別于28天和56天取肝臟組織進行分析,研究水體銅暴露對黃顙魚肝臟脂肪沉積及SREBP-1c通路的影響。結果顯示,在28天時,隨著水體銅濃度的上升,肝臟內脂肪含量、脂肪酸合成酶(FAS)活性,以及SREBP-1c通路相關基因(SREBP-1c、SCAP、ACCα和FAS)的表達水平均有所升高。在56天時,隨著水體銅濃度的升高,肝臟脂肪含量、脂肪酸合成酶(FAS)的活性,以及SREBP-1c通路相關基因(SREBP-1c、ACCα和FAS)的表達水平均有所降低。組織切片和油紅O染色的結果也進一步證實上述結論。本研究表明了水體銅暴露可以通過活化SREBP-1c而影響進而影響黃顙魚肝臟內脂肪的沉積。然后,為深入了解ER Stress及其介導的信號通路在銅影響黃顙魚脂代謝過程中的作用機制,我們探討了離體條件下,銅離子的單獨孵育及ER Stress抑制劑(4-苯基丁酸,4-PBA)對黃顙魚原代肝細胞ER Stress及其介導的信號通路的影響,以及由此對脂肪沉積及SREBP-1c通路產生的影響。結果顯示,銅離子單獨孵育的條件下,GRP78、GRP94、CRT、PERK、e IF2α、IRE-1α和XBP-1基因的表達水平均有所升高,同時,SREBP-1c通路相關基因(SREBP-1c、SCAP、ACCα和FAS)的m RNA表達水平也隨之升高。相對于單獨銅孵育組,4-PBA的添加顯著降低了GRP78、GRP94、CRT、PERK、e IF2α、IRE-1α和XBP-1的m RNA水平;4-PBA也顯著降低了SREBP-1c、SCAP、ACCα和FAS的m RNA水平,進而降低了肝臟細胞內甘油三酯(TG)的含量。研究表明,ER Stress及其介導的信號通路在銅影響黃顙魚脂肪沉積及SREBP-1c活化過程中發(fā)揮著重要作用。3.2.內質網(wǎng)應激及其介導的信號通路在銅激活蝦虎魚SREBP-1c通路過程中的作用及部分機制本研究以蝦虎魚的原代肝臟細胞為模型,探討了銅離子的單獨孵育及4-PBA的添加對肝細胞ER Stress及其介導的信號通路產生的影響,以及由此對SREBP-1c通路產生的影響。結果顯示,銅離子單獨孵育顯著上調了GRP78、CRT、PERK、e IF2α、IRE-1α、XBP-1和ATF-6α基因的表達水平;銅離子單獨孵育也上調了SREBP-1c通路相關基因(SREBP-1c、SCAP、ACCα、SCD-1和FAS)的m RNA表達水平及FAS活性。4-PBA顯著抑制了由銅離子誘導的ER Stress現(xiàn)象,并由此緩解銅離子對SREBP-1c的活化作用,進而降低了肝細胞內FAS活性及TG的含量。研究表明,ER Stress及其介導的信號通路在銅影響蝦虎魚肝細胞內脂肪沉積及SREBP-1c活化過程中扮演著重要角色。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
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本文編號：1402083