本文關(guān)鍵詞：稻瘟病菌兩個致病相關(guān)基因ZNF1和CKS1的鑒定及生物學功能分析　出處：《浙江大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病(rice blast)是水稻上的重要病害,每年可造成10-30%的稻谷產(chǎn)量損失,嚴重威脅世界水稻種植和糧食安全。由于經(jīng)濟的重要性和分子遺傳的可操作性,稻瘟病菌-水稻互作機制已成為研究病原菌-寄主植物互作的模式系統(tǒng)。對稻瘟病菌致病分子機理的深入了解不僅有利于病害防治策略的研發(fā),而且對其它植物病原真菌致病機理的認識具有指導意義。本文通過農(nóng)桿菌介導的T-DNA轉(zhuǎn)化和生物信息學分析鑒定了2個稻瘟病菌致病相關(guān)基因：ZNFl和CKS1。通過基因敲除、表型分析、熒光標記、酵母雙雜交等分子生物學技術(shù)分析了ZNF1和CKS1在稻瘟病菌形態(tài)發(fā)育和致病過程中的作用,主要研究結(jié)果如下：1.建立了T-DNA插入突變體庫,獲得了XF696等5個致病缺陷突變體為獲得與稻瘟病菌致病相關(guān)新基因,本實驗進行了三次ATMT轉(zhuǎn)化,共獲得2200個T-DNA插入突變體。其中5個突變體(XF577, XF696, XF1379, XF1521,XF1557)對寄主的致病性完全喪失。Tail-PCR以及生物信息學分析明確了5個突變體的T-DNA標記基因分別為BUF1 (MGG_02252), MGG_14931, STU1 (MGG_00692), MKK2 (MGG_06482), MST12 (MGG_12958)。其中 XF696 的T-DNA標記基因MGG_14931的生物學功能尚未報道。2.ZNF1在稻瘟病菌附著胞發(fā)育、成熟以及侵染過程中有重要作用XF696突變體中T-DNA標記基因MGG_14931編碼一個假定的C2H2鋅指蛋白,將該基因命名為ZNF1 (Maganporthe oryzae zinc finger protein)。 ZNF1 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有兩種不同的剪切形式：SⅠ和SⅡ,SⅠ為主要剪切方式,并具有正常功能,而SⅡ沒有功能。基因敲除、互補、表型分析及qRT-PCR等實驗結(jié)果表明：1)敲除ZNF1不影響稻瘟病菌營養(yǎng)生長、色素沉積以及有性生殖；2)△znf1產(chǎn)孢能力顯著增加,說明ZNF1可能負調(diào)控分生孢子的形成；3)△znf1突變體對大麥和水稻的致病性完全喪失,即使在劃傷或針刺的大麥和水稻葉片表面都不能產(chǎn)生病斑；4)△znf1突變體芽管頂端可以分化形成膨大結(jié)構(gòu),但是不能形成正常的附著胞,也不能穿透寄主表皮；5)外源cAMP或IBMX能夠誘導△znf1突變體分生孢子在親水或疏水表面上產(chǎn)生囊泡狀的膨大結(jié)構(gòu)。但外源添加cAMP或IBMX不能完全恢復△znf1附著胞形成缺陷；6)qRT-PCR以及GFP熒光檢測表明,稻瘟病菌營養(yǎng)生長和產(chǎn)孢階段ZNFl表達水平較低,而附著胞發(fā)育與成熟階段ZNFl表達水平顯著升高。在突變體△pmkl中,ZNF1表達水平受到抑制。表明ZNF1在附著胞發(fā)育階段表達水平受Pmk1 MAPK信號途徑調(diào)控；7)NileRed和I2/KI染色表明,ZNF1參與附著胞形成過程中脂滴和糖原的移動以及降解；8)H1-RFP標記顯示△znf1附著胞形成過程中,芽管尖端能進行多次有絲分裂,但細胞核不被降解,細胞自噬性降解過程受阻；9)結(jié)構(gòu)域缺失和點突變實驗顯示3個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)以及核定位信號序列(NLS)對Znfl蛋白功能起重要作用。3. CES1編碼細胞周期蛋白依賴性激酶復合物的亞基(Cyclin-dependent kinase subunit),參與稻瘟病菌營養(yǎng)生長、產(chǎn)孢、致病性等重要過程在先前的研究中,本實驗室鑒定了一個新的稻瘟病菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Soml。研究表明Soml作用于稻瘟病菌cAMP-PKA信號途徑下游,在稻瘟病菌形態(tài)分化和致病性中起關(guān)鍵作用。本研究根據(jù)△soml的SAGE (serial analysis of gene expression)表達譜測序數(shù)據(jù)并結(jié)合生物信息學分析,選取了8個可能與Soml相關(guān)的基因進行了敲除,其中△cksl表型明顯與野生型菌株不同。本實驗進一步對CKS1的生物學功能進行了分析,結(jié)果如下：1)酵母雙雜交實驗證明稻瘟病菌中Cksl與Soml之間存在互作；2)△cksl突變體營養(yǎng)生長緩慢,菌落發(fā)白,氣生菌絲蓬松,不能產(chǎn)生分生孢子；3)qRT-PCR分析顯示,色素合成基因ALB1、RSYl和BUFl,以及產(chǎn)孢相關(guān)基因COS1、CON7、ACRl1、HTF1(HOX2)在△cks1中顯著下調(diào)；4)△cksl能在菌絲尖端產(chǎn)生附著胞結(jié)構(gòu),但附著胞功能喪失,不能穿透寄主表皮,也不能在寄主組織內(nèi)進行侵染生長；5)△cks1突變體幾乎完全喪失對大麥和水稻的致病性；6)△cksl菌落疏水性下降,菌落呈現(xiàn)自溶現(xiàn)象；7)△cks1突變體對細胞壁壓力脅迫抗性增加,幾丁質(zhì)合成酶編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平在△cks1中明顯上調(diào),表明CKS1參與維持稻瘟病菌細胞壁完整性；8)小麥赤霉病菌的FgCKS1能恢復稻瘟病菌△cks1的表型缺陷,表明在絲狀病原真菌中Cks1結(jié)構(gòu)和功能都非常保守；9)Cksl-GFP融合蛋白亞細胞定位分析表明,Cks1在營養(yǎng)生長階段主要定位于細胞質(zhì)中,而分生孢子形成階段,細胞質(zhì)和細胞核中都有明顯的分布；10)結(jié)構(gòu)域缺失實驗表明Cks1蛋白中Ubiquitin-binding domain, Cdc28-binding domain 以及 Anion-binding site對Cks1蛋白發(fā)揮正常功能有重要作用；11)酵母雙雜交表明,稻瘟病菌中Cks1與細胞周期蛋白依賴性激酶Cdc28存在互作,Cdc28-GFP融合蛋白定位顯示Cdc28與Cks1有相似的胞內(nèi)定位模式。
[Abstract]:Rice blast is an important disease in rice , which can cause 10 - 30 % of rice yield loss per year . The results are as follows : 1 . The research results are as follows : 1 . The research results are as follows : 1 . The research results are as follows : 1 . The research results are as follows : 1 . We have identified two genes of rice blast disease - related genes : ZNFl and CKS1 . The expression level of ZNFl was significantly increased , but the expression level of ZNFl was significantly increased . The results were as follows : 1 ) The results showed that : 1 ) The expression of 鈻，

本文編號：1392261