本文關(guān)鍵詞：大白菜復(fù)等位基因遺傳雄性不育分子機理研究　出處：《沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：大白菜是完全花異花授粉作物,具有明顯的雜種優(yōu)勢。在配制雜交種的過程中,雄性不育材料的利用是一種較好的雜交制種途徑。大白菜雄性不育遺傳機理和分子機制研究一直是人們關(guān)注的熱點。在前期研究中,本課題組發(fā)現(xiàn)了一份大白菜復(fù)等位基因遺傳的雄性不育材料,并用其配制出了具有100%不育株率的核基因雄性不育系。利用該不育材料構(gòu)建分離群體,對不育基因進行了定位,將其定位在A07染色體6700-6800kb之間。為了克隆不育基因,本研究利用該不育系統(tǒng)的純合不育株(MsMs)構(gòu)建BAC文庫,通過篩選定位區(qū)間內(nèi)的BAC克隆,進行測序比對,尋找差異基因；通過對雄性不育“兩用系”可育株(MsfMs)與不育株(MsMs)花蕾進行轉(zhuǎn)錄組測序,找出差異表達基因并分析它們的功能和參與的代謝途徑；鑒定花蕾中表達的miRNAs,并對其進行了靶基因預(yù)測,探尋miRNA在雄蕊育性調(diào)控中的作用。上述研究結(jié)果可以為篩選鑒定大白菜核不育復(fù)等位基因(Ms、Msf和ms)奠定基礎(chǔ),并為核雄性不育相關(guān)基因和miRNAs的研究提供了數(shù)據(jù)庫,有助于揭示大白菜雄性不育的分子機制。主要研究結(jié)果如下：1.通過對大白菜雄性不育“兩用系”的不育株與可育株花蕾形態(tài)觀察,發(fā)現(xiàn)不育株除雄蕊不產(chǎn)生花粉外,其他花器官發(fā)育正常。利用石蠟切片對不育株與可育株花藥細胞結(jié)構(gòu)進行觀察,發(fā)現(xiàn)花藥發(fā)育前期兩者沒有明顯差異,后期不育株花粉母細胞不能進行正常的減數(shù)分裂,絨氈層細胞異常膨脹,導(dǎo)致不育株花藥的花粉囊皺縮。2.根據(jù)前期對大白菜雄性不育基因Ms及其恢復(fù)基因Msf的定位結(jié)果,設(shè)計篩庫引物,在利用雄性不育“兩用系”不育株葉片構(gòu)建的BAC文庫中篩選到2個對應(yīng)定位區(qū)間內(nèi)的BAC克隆,即FH20-SRF1和FH48-LCSK5。利用第3代測序技術(shù),對這2個BAC克隆進行測序,FH20-SKRF1插入基因的長度為127658bp, FH48-LCSK5為130005bp。兩個BAC克隆可以拼接,拼接后長度為233305bp,重疊區(qū)域有24358bp。在拼接后的序列中能找到篩庫引物SKRF1和LCSK5,并且定位標(biāo)記LZY6位于拼接序列68462-68849bp的區(qū)域,說明這2個BAC克隆能夠完全覆蓋A07染色體6700-6800kb區(qū)間。將拼接序列與Brassica Database中的大白菜基因組序列進行比對,發(fā)現(xiàn)部分區(qū)域發(fā)生了倒位,并有大片段插入。對拼接序列進行基因預(yù)測,共預(yù)測到57個基因。在MsfMsf基因型材料中將這57個基因進行克隆測序,發(fā)現(xiàn)有7個基因的序列與MsMs基因型材料的BAC克隆存在差異,且這7個基因全部位于插入片段區(qū)域。3.利用RNA-seq技術(shù),對大白菜雄性不育“兩用系”可育株與不育株的花蕾進行測序分析,按照無參考基因組進行unigene組裝,分別得到了70703和70799個unigene。將BAC克隆測序比對得到的7個存在序列差異的基因,與unigene進行比對,有5個能夠比對上,說明這5個基因真實存在并且能夠正常表達。4.對大白菜雄性不育“兩用系”可育株與不育株花蕾中的基因表達水平進行分析,發(fā)現(xiàn)有1013個差異表達基因,包括與花粉發(fā)育相關(guān)的AMS、MS2、VGD1以及果膠酶類基因等等。在這些差異表達基因中,有475個在可育花蕾中特異性表達,6個在不育花蕾中特異性表達。這些特異性表達基因中有82個基因編碼未知功能蛋白,其中大部分在花粉和花粉萌發(fā)階段表達。對差異表達基因進行GO富集分析,顯著富集的GO terms有19個。對所有的差異表達基因進行pathway富集分析,共富集到5條pathway,分別是：①戊糖和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換途徑、②丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝途徑、③半胱氨酸和蛋氨酸代謝途徑、④維生素C代謝途徑、⑤淀粉蔗糖代謝途徑。利用qRT-PCR對其中的30個差異表達基因在“兩用系”可育株與不育株花蕾中的表達量進行分析,其結(jié)果與測序結(jié)果一致,驗證了測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。5.以大白菜雄性不育“兩用系”可育株與不育株花蕾為試材,分別構(gòu)建small RNA測序文庫,進行高通量測序,在兩文庫中分別獲得了132和144個已知的miRNA,并預(yù)測到22和24個新的miRNA。對35個已知的miRNA家族進行了靶基因預(yù)測,并對靶基因進行了功能注釋。篩選出19個miRNA在不育株與可育株花蕾中差異表達。在這19個差異表達的miRNA中,大部分在不育花蕾中表達量高,只有5個在可育花蕾中表達量高。這些差異表達的miRNA的靶基因,部分與花、雄蕊、花粉的發(fā)育相關(guān),例如AP2、果膠甲酯酶抑制劑家族蛋白等。有5個miRNA的靶基因在轉(zhuǎn)錄組測序中也為差異表達基因,說明其可能受miRNA調(diào)控。對所有差異表達的miRNA進行qRT-PCR驗證,其結(jié)果與測序結(jié)果大體相同,驗證了測序結(jié)果的可靠性。
[Abstract]:In order to clone the sterile gene , the genetic mechanism and molecular mechanism of male sterile plants were identified . In this study , we found that there were a number of differentially expressed genes , including AMS , MS 2 , VGD1 and pectinase genes .

【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S634.1

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本文編號：1390015