本文關(guān)鍵詞：狗牙根耐寒生理及分子機(jī)制解析　出處：《中國(guó)科學(xué)院研究生院(武漢植物園)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：低溫是限制植物生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖以及地理分布的一個(gè)重要環(huán)境因子。通過(guò)生理生化以及分子等技術(shù)手段來(lái)研究植物耐寒機(jī)制,進(jìn)而提高植物尤其是經(jīng)濟(jì)作物的耐寒性,具有重要的意義。近年來(lái),隨著研究技術(shù)的不斷更新,國(guó)內(nèi)外在植物耐寒性研究方面得到了長(zhǎng)足發(fā)展,研究人員從生理生態(tài)以及蛋白組、代謝組、轉(zhuǎn)錄組等不同層面,多角度解析了植物的耐寒機(jī)理,挖掘到大量耐寒優(yōu)異基因,并通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高了植物的耐寒性。狗牙根(Cynodon dactylon)屬禾本科多年生草本植物,廣泛分布于熱帶、亞熱帶以及暖溫帶,是一種典型的暖季型草種。狗牙根的應(yīng)用廣泛,可作為草坪草應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)場(chǎng)、高爾夫球場(chǎng)、公園及庭院等等；由于狗牙根生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高,對(duì)牲畜適口性好,也可作為牧草；此外,狗牙根生活力強(qiáng),繁殖迅速可選作優(yōu)良的護(hù)坡植物。因此,狗牙根在經(jīng)濟(jì)、農(nóng)林、環(huán)境等方面都有較好的發(fā)展前景,但由于其最適生長(zhǎng)溫度在30℃左右,溫度低于10℃就出現(xiàn)萎黃,出現(xiàn)冷季休眠,耐寒性不足,其推廣應(yīng)用也被低溫所限制。本研究對(duì)采集自我國(guó)不同地區(qū)的野生狗牙根種質(zhì)進(jìn)行了耐寒性篩選,建立了狗牙根耐寒表型數(shù)據(jù)庫(kù),并從中篩選鑒定了相對(duì)極端耐寒和對(duì)低溫敏感的野生狗牙根種質(zhì)。利用144對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)狗牙根種質(zhì)進(jìn)行了基因型標(biāo)定和群體結(jié)構(gòu)分析；基于基因型、表型和群體結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)分析,發(fā)掘與野生狗牙根耐寒性相關(guān)的分子標(biāo)記,為狗牙根耐寒育種奠定基礎(chǔ)；通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),挖掘狗牙根耐寒基因；外施小分子物質(zhì),探索提高狗牙根耐寒性有效且快速的方法。主要研究結(jié)果如下：1.野生狗牙根種質(zhì)抗寒表型鑒定及耐寒表型數(shù)據(jù)庫(kù)建立在低溫脅迫處理下,對(duì)不同來(lái)源的狗牙根種質(zhì)的耐寒功能性狀進(jìn)行測(cè)試分析,利用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)法對(duì)其耐寒能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),建立了狗牙根耐寒表型數(shù)據(jù)庫(kù)。結(jié)果表明,不同地理來(lái)源的狗牙根種質(zhì)的耐寒能力多樣性豐富,存在著較大變異；狗牙根耐寒性與其緯度來(lái)源關(guān)系密切,一般來(lái)說(shuō)緯度較高來(lái)源的種質(zhì)耐寒性較強(qiáng),反之,緯度較低來(lái)源的種質(zhì)耐寒性較弱。利用功能性狀判別和聚類(lèi)分析,發(fā)現(xiàn)地理來(lái)源相同或相近的狗牙根種質(zhì)能夠聚類(lèi)在一起。通過(guò)綜合評(píng)價(jià),最終篩選到了相對(duì)耐寒和低溫敏感的野生狗牙根各5份。2.狗牙根耐寒性狀關(guān)聯(lián)分析通過(guò)SSR標(biāo)記和耐寒表型數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析,群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,供試的106份狗牙根種質(zhì)被分為2個(gè)亞群,其中來(lái)源于西北(主要為新疆)地區(qū)的種質(zhì)被劃為同一個(gè)亞群。SSR的聚類(lèi)分析結(jié)果顯示,緯度來(lái)源相同或相近的種質(zhì)趨于聚在一起。基于基因型、表型和群體結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)分析,在P0.01水平下發(fā)掘到285個(gè)SSR位點(diǎn)與耐寒性狀相關(guān)聯(lián)；通過(guò)進(jìn)一步校正之后,在P3.5×104水平下,有15個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的SSR位點(diǎn),最高解釋度達(dá)到了57%,其中位點(diǎn)CDGA2-1011-1012、CDCA1-27-28和CDCA2-203-204等3個(gè)位點(diǎn)同時(shí)與多個(gè)不同的性狀相關(guān)聯(lián)。3.狗牙根耐寒相關(guān)基因的挖掘、功能鑒定及抗寒分子機(jī)理解析利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),發(fā)掘到多個(gè)參與狗牙根低溫脅迫應(yīng)答的基因,例如鈣信號(hào)通路相關(guān)基因,轉(zhuǎn)錄因子家族成員：CBF、NAC、WRKY和bHLH等。通過(guò)分析比較不同處理?xiàng)l件下差異表達(dá)基因的規(guī)律,我們發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫下,與對(duì)低溫敏感種質(zhì)相比,耐寒狗牙根種質(zhì)能夠更快的調(diào)節(jié)基因表達(dá)來(lái)參與低溫脅迫應(yīng)答,且一些低溫誘導(dǎo)基因的表達(dá)量在耐寒種質(zhì)中的表達(dá)水平更高；經(jīng)過(guò)4℃低溫馴化后,與對(duì)低溫敏感種質(zhì)相比,狗牙根耐寒種質(zhì)能夠更加有效的調(diào)節(jié)基因表達(dá)來(lái)應(yīng)答零下冷凍(-5℃)脅迫。KEGG代謝通路富集分析表明光系統(tǒng)調(diào)節(jié)、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等與狗牙根的耐寒性密切相關(guān)。利用RACE技術(shù)從上述差異表達(dá)的候選基因中,克隆鑒定了一個(gè)編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子的基因,并命名為CdWRKYl,通過(guò)病毒介導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)對(duì)CdWRKYl基因進(jìn)行了功能驗(yàn)證,初步的研究表明CdWRKYl基因參與調(diào)節(jié)狗牙根的耐寒性。4.小分子物質(zhì)參與調(diào)節(jié)狗牙根的耐寒性我們調(diào)查了外源施加小分子物質(zhì)對(duì)狗牙根耐寒性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),外施一氧化氮(NO)和褪黑素(MLT)之后,低溫脅迫下狗牙根細(xì)胞膜的穩(wěn)定性增強(qiáng),抗氧化酶活性提高。葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),PSII過(guò)程中的電子和能量傳遞鏈明顯改善�；贕C-MS技術(shù),對(duì)代謝產(chǎn)物分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),外施MLT之后,在低溫脅迫下,狗牙根體內(nèi)耐寒相關(guān)的代謝產(chǎn)物含量明顯升高。這些結(jié)果表明NO和MLT通過(guò)調(diào)節(jié)生理和代謝過(guò)程來(lái)提高狗牙根的耐寒性。綜上,我們對(duì)我國(guó)不同地區(qū)的野生狗牙根進(jìn)行了耐寒綜合評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)其耐寒性與其緯度來(lái)源呈正相關(guān)關(guān)系；通過(guò)關(guān)聯(lián)分析,我們發(fā)掘到了15個(gè)SSR位點(diǎn)與狗牙根的耐寒性相關(guān)；并且,我們基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)挖掘到了大量與狗牙根的耐寒相應(yīng)基因；此外我們還發(fā)現(xiàn)了NO和MLT能提高狗牙根的耐寒性。本研究為狗牙根耐寒機(jī)制進(jìn)行了多方面解析,并未來(lái)的狗牙根耐寒育種提供了重要依據(jù)。
[Abstract]:In recent years , with the continuous updating of research technology , it has been widely distributed in tropical , subtropical and warm temperate zones . It has been widely distributed in tropical , subtropical and warm temperate zones . The results were as follows : 1 . The results were as follows : 1 . The identification of cold resistance and cold tolerance of dog tooth root were analyzed by means of the correlation analysis of genotype , phenotype and population structure . The results showed that NO and MLT could improve the cold tolerance of dog roots by regulating the physiological and metabolic processes . The results showed that NO and MLT could improve the cold tolerance of dog roots by regulating physiological and metabolic processes .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院研究生院(武漢植物園)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S688.4

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