發(fā)布時(shí)間：2018-01-03 18:15

  本文關(guān)鍵詞：AIM2在鼠傷寒沙門菌感染中的作用及機(jī)制研究　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 緊密銜接 上皮屏障 AIM2 鼠傷寒沙門菌 腸炎 Akt

【摘要】：黑色素瘤缺乏因子AIM2是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種DNA受體,是HIN200家族成員之一,最先作為一種黑色素瘤抑制基因而被發(fā)現(xiàn)。該基因含有不穩(wěn)定的微衛(wèi)星位點(diǎn),在許多腫瘤疾病中該位點(diǎn)發(fā)生突變,導(dǎo)致AIM2基因失活、功能缺失。目前,關(guān)于AIM2功能的報(bào)道主要是作為細(xì)胞質(zhì)DNA受體,能夠與ASC和caspase-1形成炎性復(fù)合體,參與宿主對多種DNA病毒和胞內(nèi)菌的天然免疫反應(yīng)。有研究表明,沙門菌不能夠活化骨髓來源巨噬細(xì)胞中的AIM2炎性體,AIM2在沙門菌感染中的作用尚不清楚。為了探索AIM2在沙門菌感染中的作用,更好的理解宿主對沙門菌的固有免疫反應(yīng),本課題利用AIM2基因缺失小鼠,通過沙門菌誘導(dǎo)的腸炎模型,分析AIM2在沙門菌感染中的作用,并闡明其分子調(diào)控機(jī)制,以期為沙門菌病的防治提供理論指導(dǎo)。首先,我們分別用沙門菌黏膜感染和沙門菌系統(tǒng)感染W(wǎng)T和AIM2基因缺失小鼠,分析AIM2在沙門菌感染中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AIM2基因缺失小鼠對沙門菌黏膜感染更為易感,表現(xiàn)為更高的死亡率,肝臟和脾臟組織荷菌數(shù)顯著增加;表明AIM2能夠抗沙門菌感染。沙門菌進(jìn)入腸道后,打破黏膜屏障,擴(kuò)散全身引起系統(tǒng)感染。因此,兩種基因型小鼠對沙門菌黏膜感染易感性的差異可能是由于腸道屏障功能存在缺陷引起的,也可能是由于機(jī)體對細(xì)菌的清除能力存在差異引起的。因此,我們進(jìn)行了沙門菌的系統(tǒng)感染分析兩種基因型小鼠對細(xì)菌的清除是否存在差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在沙門菌系統(tǒng)感染中,WT和AIM2缺失小鼠對沙門菌具有相似的易感性,表明兩種基因型小鼠對細(xì)菌的清除并不存在差異。以上結(jié)果提示我們可能腸道中的AIM2發(fā)揮了抗沙門菌感染的作用。因此,我們將AIM2的功能限定在腸道,并著重分析AIM2對沙門菌誘導(dǎo)腸炎的影響。為了進(jìn)一步探索AIM2是否能夠調(diào)控局部腸道免疫反應(yīng),隨后進(jìn)行沙門菌黏膜感染。結(jié)果發(fā)現(xiàn),同野生型小鼠相比,AIM2基因缺失小鼠表現(xiàn)出更為明顯的體重減輕;感染后第2天,脾臟重量增加明顯,盲腸損傷更為嚴(yán)重;盲腸,肝臟,脾臟,腸系膜淋巴結(jié)組織荷菌數(shù)顯著增加;盲腸組織炎性細(xì)胞因子釋放顯著增加;感染后第3天,4天,5天,AIM2基因缺失小鼠盲腸部位組織病理損傷更為嚴(yán)重。以上結(jié)果表明AIM2能夠限制沙門菌誘導(dǎo)的腸炎,有利于腸道穩(wěn)態(tài)的維持。腸道上皮細(xì)胞的更新對于腸道屏障的完整和腸道穩(wěn)態(tài)的維持具有重要意義。因此,我們隨后檢測AIM2對腸道上皮細(xì)胞更新的影響。首先,通過免疫熒光的方法檢測盲腸上皮細(xì)胞增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),同WT小鼠相比,在未感染沙門菌的情況下,AIM2基因缺失小鼠盲腸上皮細(xì)胞增殖數(shù)量增加;而在沙門菌感染2天后,AIM2基因缺失小鼠盲腸上皮細(xì)胞增殖數(shù)量減少。隨后,通過TUNEL染色和western blot的方法,對腸上皮細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),同WT小鼠相比,AIM2基因缺失小鼠在感染沙門菌后,腸上皮細(xì)胞凋亡增加。由以上結(jié)果可知,AIM2有利于腸上皮細(xì)胞增殖和凋亡穩(wěn)態(tài)的維持。盡管,我們不能排除沙門菌感染后AIM2基因缺失小鼠異常的腸上皮細(xì)胞更新可能是由于過度的腸道炎癥引起的,但是在未感染沙門菌的情況下,AIM2基因缺失小鼠異常的腸上皮細(xì)胞增殖可能導(dǎo)致腸道屏障功能減弱,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌的異常擴(kuò)散。為了驗(yàn)證這種可能,我們檢測感染早期,細(xì)菌穿過上皮屏障擴(kuò)散到深層組織的情況。沙門菌黏膜感染W(wǎng)T和AIM2基因缺失小鼠3小時(shí)后,AIM2基因缺失小鼠腸系膜淋巴結(jié),腸道黏膜固有層細(xì)菌數(shù)量顯著增加。由此說明AIM2基因缺失后,腸道屏障功能減弱。為了進(jìn)一步論證這一發(fā)現(xiàn),我們在體外Caco-2細(xì)胞系上過表達(dá)了AIM2,并檢測沙門菌穿過細(xì)胞單層的數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),AIM2過表達(dá)后,細(xì)菌從細(xì)胞旁通路穿過單層上皮細(xì)胞的數(shù)量顯著減少。由此說明AIM2能夠促進(jìn)單層細(xì)胞屏障功能,限制細(xì)菌經(jīng)細(xì)胞旁通路擴(kuò)散。緊密銜接是細(xì)胞旁通路中一種重要的屏障結(jié)構(gòu),封閉細(xì)胞與細(xì)胞之間的縫隙。因此,我們對細(xì)胞旁緊密銜接蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。通過免疫熒光,western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測緊密銜接蛋白在盲腸部位的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在未感染沙門菌的情況下,AIM2缺失小鼠盲腸緊密銜接蛋白claudin3的表達(dá)降低,occludin的m RNA表達(dá)量降低,ZO-1的m RNA表達(dá)不受影響。隨后進(jìn)一步驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn),我們對Caco-2細(xì)胞系和過表達(dá)AIM2的Caco-2細(xì)胞系中claudin3的表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),AIM2過表達(dá)后,claudin3的表達(dá)增加,且單層細(xì)胞的跨膜電阻增加。而沙門菌感染后,claudin3的表達(dá)降低,但是AIM2過表達(dá)的Caco-2細(xì)胞中claudin3的表達(dá)水平高于Caco-2細(xì)胞。以上結(jié)果表明,AIM2能夠促進(jìn)緊密銜接蛋白的表達(dá),促進(jìn)腸道屏障功能的完整,從而限制沙門菌在腸道內(nèi)的擴(kuò)散。隨后,我們進(jìn)一步分析AIM2的這種調(diào)節(jié)作用是如何實(shí)現(xiàn)的。體外研究發(fā)現(xiàn),AIM2過表達(dá)的Caco-2細(xì)胞中,Akt的磷酸化水平增加;在沙門菌感染30 min,60 min后,Akt的磷酸化水平逐漸降低,claudin3的表達(dá)也逐漸降低,沙門菌感染120 min后,Akt磷酸化水平升高,claudin3的表達(dá)水平也隨之升高。隨后采用Akt抑制劑處理細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Akt抑制劑能夠抑制AIM2介導(dǎo)的claudin3表達(dá)水平的上調(diào)和細(xì)胞跨膜電阻的增加,抑制AIM2介導(dǎo)的限制細(xì)菌穿過單層細(xì)胞作用。但是AIM2介導(dǎo)的這些作用不受caspase-1抑制劑的影響。以上結(jié)果表明,AIM2能夠通過Akt信號促進(jìn)緊密銜接蛋白的表達(dá)。終上所述,AIM2缺失后,緊密銜接蛋白表達(dá)降低,腸道屏障功能減弱,更利于沙門菌擴(kuò)散到深層組織,從而導(dǎo)致AIM2基因缺失小鼠對沙門菌誘導(dǎo)的腸炎更為易感。
[Abstract]:In order to explore the effect of the two genotypes on the infection of Salmonella , it was found that the effect of the two genotypes on the infection of Salmonella was not clear . In order to explore the effect of the two genotypes on the infection of Salmonella , we found that the two genotypes had a similar susceptibility to Salmonella infection . The results showed that the two genotypes of Salmonella typhimurium had a similar susceptibility to Salmonella infection . The results showed that the proliferation of intestinal epithelial cells was decreased after infection of Salmonella in mice . The results showed that in the absence of Salmonella infection , the proliferation of intestinal epithelial cells was decreased . In vitro studies have found that the level of phosphorylation is increased . After 30 min and 60 min of infection , the level of phosphorylation and the level of phosphorylation of claudin 3 are gradually decreased , and the expression of claudin 3 is increased .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S855.1

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本文編號：1375020