本文關(guān)鍵詞：利用單細胞測序技術(shù)剖析玉米遺傳重組交換和單倍體誘導的機制　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：單細胞測序技術(shù)是近幾年快速發(fā)展的一種新技術(shù),雖然廣泛應用于人類和動物遺傳學,胚胎學和免疫學等學科的研究和疾病的診斷與治療,但是植物單細胞測序研究仍然困難重重。本研究以玉米的花粉為模式材料,探索植物單細胞的分離和測序技術(shù),建立相應的分析平臺。在此基礎上,通過兩個實例研究探討單細胞測序技術(shù)在植物領域的應用:1)通過對玉米四分體的四個小孢子的測序分析,首次在單細胞水平探討了植物重組的遺傳基礎;2)通過對不同時期玉米單倍體誘導系的花粉進行測序分析,探討了玉米單倍體誘導(Haploid induction,HI)發(fā)生的機制和規(guī)律。主要結(jié)果如下:1.發(fā)展一種分離植物單個四分體孢子的方法,用于基因組多重置換擴增(Multiple Displacement Amplification,MDA)。對來自24個F1四分體的96個小孢子的擴增DNA樣品進行了全基因組重測序,平均深度為1.4X,平均基因組覆蓋度為41%。通過測序,共獲得599,154高密度的SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)標記,其相鄰SNP物理間距的中位數(shù)為235bp。通過比較小孢子基因組的遺傳背景,共鑒定到924個被精細定位的同源重組交換(Crossover,CO),發(fā)現(xiàn)玉米一次減數(shù)分裂平均發(fā)生38.5個CO。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),CO更傾向于發(fā)生在靠近基因的區(qū)域,而且常常富集于基因的5’和3’末端。通過對5個CO區(qū)段進行Sanger測序,在每個區(qū)段中都發(fā)現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)換(Gene Conversion,GC),表明CO的產(chǎn)生常伴隨著GC的發(fā)生。首次在小孢子中檢測到了較強的交換負干涉和較弱的染色單體干涉。本研究在增強對減數(shù)分裂重組發(fā)生機制理解的同時,也為進一步提高育種效率提供了新思路。2.發(fā)展一種分離誘導系CAU5成熟花粉單核的方法。利用該方法,分離到來自22個CAU5花粉的66個單核。同時分離到來自18個CAU5四分體的72個小孢子。將CAU5的單核及單細胞樣品進行基于PCR的全基因組擴增(Whole Genome Amplification,WGA)后,對其進行高通量測序和拷貝數(shù)變異(Copy Number Variation,CNV)分析。發(fā)現(xiàn)誘導系CAU5在三核花粉期存在高頻的染色體非整倍性變異(6/22個花粉),而在四分體時期只存在很低頻的倍性異常(1/72個小孢子),這說明誘導系的花粉在減數(shù)分裂期之后會產(chǎn)生染色體的片段化現(xiàn)象。3.發(fā)展一種分離常規(guī)自交系單精子的方法。利用該方法,分離到來自普通自交系B73的25個花粉的50個單精子和來自B73背景的誘導系(B73-inducer,80%的B73背景和20%的CAU2誘導系背景)的26個花粉的52個單精子,然后進行基于PCR的全基因組擴增,對其進行高通量測序和CNV分析。在B73-inducer的單精核中發(fā)現(xiàn)高頻的染色體非整倍性(14/52精核)變異,頻率遠遠高于自交系B73(3/50精核),說明單倍體誘導的發(fā)生可能和花粉精核的非整倍性變異相關(guān)。4.為了進一步證明花粉染色體片段化與單倍體胚誘導之間的關(guān)系,對來自與誘導系雜交授粉后9天的88個籽粒中的81個胚和81個胚乳DNA進行高通量測序分析。在7個胚中發(fā)現(xiàn)了父源基因組的全部消除。在1個胚中發(fā)現(xiàn)了大部分父源基因組的消除,但仍有少部分殘余。在3個樣品中檢測到小片段的CNV�；谝陨蠑�(shù)據(jù),得出結(jié)論:染色體的片段化是單倍體誘導的潛在原因之一,而且是一個持續(xù)發(fā)生的過程,當染色體已片段化的精核和卵細胞結(jié)合后,就可能發(fā)生父源染色體的消除,從而誘導產(chǎn)生單倍體。這個結(jié)果不僅支持單倍體誘導的雙受精假說,同時也為解析單倍體誘導機制提供了新的視角和手段,在誘導系的培育和改良方面具有潛在的利用價值。
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【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S513

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本文編號：1353032