本文關(guān)鍵詞：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在布魯氏菌體外感染山羊子宮內(nèi)膜與滋養(yǎng)層細(xì)胞中的作用　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：懷孕母畜流產(chǎn)是布魯氏菌侵染宿主后所引發(fā)的最主要的并發(fā)癥。滋養(yǎng)層細(xì)胞是除單核-巨噬細(xì)胞外布魯氏菌侵染的主要靶細(xì)胞,子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞是與滋養(yǎng)層細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上密切相關(guān)的細(xì)胞。研究證實(shí)布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的侵染、增殖與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum,ER)密切相關(guān),布魯氏菌能夠利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為其在細(xì)胞內(nèi)的增殖部位,從而逃避宿主免疫系統(tǒng)的殺傷。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也是細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)合成、運(yùn)輸、分泌的主要場所,對于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用。當(dāng)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)因?yàn)椴≡母腥径淮蚱?就會引發(fā)宿主細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress,ER stress)和未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)來恢復(fù)細(xì)胞的正常功能。布魯氏菌進(jìn)入宿主細(xì)胞后ERA-BCV(Endoplasmic reticulum associated-Brucella containing vacuoles)的形成和宿主細(xì)胞凋亡的抑制是其逃避殺傷、進(jìn)而生存和增殖的關(guān)鍵。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡缺失引起的ER stress是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。然而,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在布魯氏菌侵染懷孕母畜子宮并引起懷孕母畜流產(chǎn)的機(jī)制至今尚不清楚。本研究利用豬布魯氏菌S2株(Brucella suis strain 2,B.suis S2)體外感染山羊滋養(yǎng)層細(xì)胞和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞,利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)的各種抑制劑、激活劑和免疫熒光,基因的過表達(dá)和沉默,熒光定量RT-PCR,流式細(xì)胞術(shù),Western Blot等相關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)來探索(1)布魯氏菌S2株對山羊滋養(yǎng)層細(xì)胞和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的侵染能力;(2)布魯氏菌S2株增殖對山羊滋養(yǎng)層細(xì)胞和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡的影響;(3)布魯氏菌S2株增殖對山羊滋養(yǎng)層細(xì)胞和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞ER stress的激活;(4)操控滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)對布魯氏菌S2株增殖的影響;(5)布魯氏菌S2株增殖對山羊滋養(yǎng)層細(xì)胞和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞生物活性的影響。1.通過激光共聚焦顯微鏡及菌落計(jì)數(shù)的方法,發(fā)現(xiàn)布魯氏菌S2株無論是對親嗜性的滋養(yǎng)層細(xì)胞還是非親嗜性的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞都表現(xiàn)出一定的感染性,且在這兩種細(xì)胞內(nèi)隨著感染時(shí)間增加具有明顯的增殖現(xiàn)象。2.通過流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光、Western Blot和熒光定量PCR的方法,發(fā)現(xiàn)布魯氏菌S2株感染不同的細(xì)胞對其損害程度不同,對于其靶細(xì)胞滋養(yǎng)層的侵染能夠引起宿主細(xì)胞的凋亡并且伴發(fā)相應(yīng)的細(xì)胞凋亡信號分子的表達(dá)。而對于其非靶細(xì)胞山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的侵染,并沒有引起山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡和相應(yīng)的凋亡信號分子的顯著改變。因此,布魯氏菌侵染對滋養(yǎng)層細(xì)胞的損害可能是引發(fā)流產(chǎn)的主要原因。3.通過免疫熒光、Western Blot和熒光定量PCR的方法,發(fā)現(xiàn)布魯氏菌S2株無論是在親嗜性的滋養(yǎng)層細(xì)胞還是在非親嗜性的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞內(nèi)增殖過程中,都激發(fā)了宿主細(xì)胞相應(yīng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。然而,激活的UPR通路不同,最主要的原因是不同宿主細(xì)胞對布魯氏菌侵染所表現(xiàn)出的抵抗力不同。4.通過免疫熒光、Western Blot和熒光定量PCR的方法,利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑(Tm)、抑制劑(4-PBA),IRE1抑制劑(Irestatin 9389),自噬抑制劑(氯喹)和GRP78基因過表達(dá)和沉默等操控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘發(fā)的宿主細(xì)胞凋亡反應(yīng)和自噬反應(yīng)影響到了布魯氏菌S2株在滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)的增殖,然而僅僅影響滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)IRE1α蛋白表達(dá)對布魯氏菌S2株的在滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)增殖沒有顯著地影響。5.利用山羊胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng)及孕激素的聯(lián)合使用,體外構(gòu)建了山羊妊娠子宮模型,發(fā)現(xiàn)布魯氏菌S2株對妊娠子宮體外模型侵染的過程中,主要通過打破滋養(yǎng)層細(xì)胞的內(nèi)分泌平衡和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的容受性而不是損害滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和侵襲能力來引起妊娠母畜的流產(chǎn)和早產(chǎn),這一過程同樣伴隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。以上結(jié)果表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在布魯氏菌S2株體外感染山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞過程中起著重要的作用,布魯氏菌S2株在山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)的增殖激活了不同的ER stress-UPR通路。宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞凋亡和自噬反應(yīng)影響了布魯氏菌S2株在滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)的增殖。此外,布魯氏菌S2株在侵染并激活山羊子宮內(nèi)膜和滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的同時(shí),損害了滋養(yǎng)層細(xì)胞的內(nèi)分泌平衡和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的容受性。本研究從病原入侵,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和生殖內(nèi)分泌角度探索了布魯氏菌侵染導(dǎo)致流產(chǎn)的部分機(jī)制。我們的研究結(jié)果將為完善布魯氏菌感染的調(diào)控機(jī)理提供新的理論依據(jù)。同時(shí)為全面認(rèn)識布魯氏菌導(dǎo)致不育、流產(chǎn)的機(jī)制提供依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S857.21
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本文編號：1351343