本文關鍵詞：Hfq對肺炎克雷伯菌耐藥性影響和機制初探及Hfq抑制劑虛擬篩選　出處：《吉林大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae)是一種革蘭氏陰性菌,在自然界中分布廣泛,能夠引起人類和動物的肺炎、尿路感染、細菌性腦膜炎和敗血癥,以及多種呼吸道和胃腸道疾病,是重要的人獸共患病病原體。尤其是近年來,肺炎克雷伯菌(簡稱為肺克菌)被認定為是一類嚴重的多藥物耐藥菌,同時因為其在全球范圍內傳播,從而引發(fā)了重大的公共衛(wèi)生問題,對人類和動物的身體健康和生命安全造成了巨大威脅。肺克菌的耐藥情況目前非常嚴重。該菌是碳青霉烯類抗生素耐藥菌感染的主要病原體之一,同時對第三代頭孢菌素類藥物耐藥嚴重,可以說對于該菌的治療已經近乎面臨無藥可用的地步。肺克菌是一類分布廣泛、致病譜廣的機會致病菌,鑒于其在臨床上的耐藥情況異常嚴峻,探究肺克菌耐藥機制,為臨床治療肺克菌感染開辟新的途徑具有重要意義。Hfq蛋白是細菌基因表達重要的轉錄后調控因子,它能介導s RNA與m RNA之間的相互作用,影響m RNA的穩(wěn)定性,促進或阻礙m RNA翻譯。這種基因調控機制對細菌是至關重要的,能夠影響細菌多種細胞過程和生理生化反應,尤其是對宿主菌的生長、代謝及毒力等方面都具有重要調控作用。Hfq蛋白對肺克菌基因表達有全局性影響,本實驗探究該蛋白對肺克菌耐藥性影響及其調控機制無疑對更加深入理解肺克菌耐藥性的形成過程具有重要意義,同時也可能為研究開發(fā)防治肺克菌感染性疾病的藥物提供新的思路。本實驗中首先利用基于Red-重組系統(tǒng)方法將hfq基因敲除,構建肺克菌hfq突變株。然后通過藥物敏感性試驗,考察肺克菌野生株和hfq突變株藥物敏感性的差異,說明hfq對肺克菌耐藥性的影響。Δhfq株對頭孢菌素類藥物、美羅培南、左氧氟沙星、替加環(huán)素、阿奇霉素、嗎啉VA酮的耐藥性均比野生株耐藥性有所上升,對多肽類藥物和利福平的藥物敏感性與野生株一致,而對氨基糖苷類藥物的藥物敏感性有所下降。研究中同時構建了Δhfq回復株,其耐藥性和野生株基本一致。本研究選擇了頭孢菌素類藥物進行時間-殺菌曲線試驗,說明Δhfq株在更高濃度的頭孢菌素類藥物下的存活能力遠遠強于野生株的存活能力,進一步證明了hfq的突變會導致肺克菌對頭孢菌素類藥物耐藥性的增強。鑒于Hfq是全局性調控因子,本實驗考察了與肺克菌耐藥性密切相關的外排泵基因acr B和oqx B及其調控因子ram A、mar A、sox S,主要外膜孔道蛋白Omp35、Omp36在野生株和Δhfq株中的表達情況,同時還用結晶紫染色定量法檢測了野生株和Δhfq株形成生物被膜的能力。結果表明,相對野生株,acr B、oqx B、sox S和mar A表達量均有所升高,外膜蛋白Omp35基因表達量下降而Omp36基因表達量有所上升,同時Δhfq株生物被膜的形成能力顯著增強。鑒于對頭孢菌素類藥物耐藥性變化較大,本實驗還利用熒光定量PCR的方法分析了青霉素結合蛋白在Δhfq株和野生株中的表達情況。結果發(fā)現肺克菌中主要的9種PBPs,除了PBP4的表達量略有上升外,其余8種PBPs的表達量均有所下降,尤其是PBP6b和PBP7,下降具有顯著的統(tǒng)計學差異(p0.05),說明這兩種PBPs受到Hfq蛋白的調控作用較強,暗示他們參與了Hfq蛋白對頭孢菌素類藥物耐藥性的調控。細菌中Hfq蛋白對基因的調控作用主要是透過介導s RNA和m RNA之間的相互作用來實現的。對肺克菌s RNA進行研究,發(fā)現新的s RNA或者s RNA新的功能,將在新的層次中對Hfq蛋白調控肺克菌耐藥機制有更進一步的理解,同時也有望為肺克菌疾病藥物的研發(fā)提供新的思路。本研究利用生物信息學方法,在肺克菌中共預測出了59條候選s RNA序列。通過PCR和RT-PCR的方法,驗證出32個候選s RNA。為了進一步確定這些候選s RNA中哪些與肺克菌耐藥性相關,本實驗研究利用半定量比較分析的方法考察這些候選s RNA在不同抗生素處理條件下的轉錄本豐度,從而發(fā)現與肺炎克雷伯菌耐藥性相關的s RNA。頭孢菌素和氨基糖苷類抗生素聯(lián)用是目前臨床上治療肺克菌感染的常見用藥方案。盡管hfq突變株對頭孢菌素耐藥性升高,但對氨基糖苷類藥物耐藥性卻有所降低。還有,肺克菌生物被膜對氨基糖苷類抗生素的耐藥程度與懸浮菌相同,說明降低這類抗生素的用藥濃度會有效降低治療生物被膜產生感染的用藥劑量。同時,肺克菌hfq突變株的毒力和侵襲力大幅減弱,因此,Hfq蛋白抑制劑與氨基糖苷類藥物的聯(lián)合使用有望成為臨床治療肺克菌感染的有效策略。本研究利用以結構為基礎的藥物設計方法,通過同源模建、活性位點預測及分子對接的方法在小分子化合物的類藥性化合物庫中對肺克菌Hfq抑制劑進行篩選。依據小分子配體和受體蛋白的結合能以及ADMET檢測結果,篩選得到10個具有Hfq抑制活性的候選分子。其中ZINC25147445具有最低結合能為-11.4kcal/mol。通過Autodock軟件進行分子對接以考察具有最低結合能的三個小分子ZINC25147445、ZINC35363745和ZINC20859128抑制Hfq蛋白的分子機制。結果顯示小分子配體和Hfq蛋白之間存在著疏水作用力、氫鍵和π-π堆積力。其中Hfq蛋白上的GLN8,GLN41,PHE42,TYR55,LYS56和HIS57是主要的結合位點。綜上所述,Hfq對肺克菌耐藥性具有重要影響。這種影響是Hfq通過調控肺克菌外排泵表達、外膜孔道蛋白表達、生物被膜形成以及藥物靶標表達來實現的,是多種機制共同作用的結果。本實驗利用生物信息學和實驗驗證相結合的方法發(fā)現肺克菌內可能存在的與肺克菌耐藥相關的s RNA,Hfq對肺克菌耐藥性的調控是否通過這些s RNA來實現是下一步研究的重點方向。此外,本實驗還依靠計算機手段虛擬篩選出一批Hfq潛在抑制劑,期望為研發(fā)防治肺克菌感染藥物開辟新思路。這些發(fā)現與研究為進一步闡明肺克菌耐藥機理提供基礎,同時為臨床研發(fā)抗肺克菌感染藥物提供了新的策略。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61

【參考文獻】

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本文編號：1349816