本文關(guān)鍵詞：藏豬腸道中拮抗致病菌微生物的篩選及其抗菌肽研究　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：抗生素的發(fā)明和使用,對(duì)人類和動(dòng)物疾病防控發(fā)揮了極其重要的作用,但其廣泛而超標(biāo)應(yīng)用導(dǎo)致了抗藥菌株的產(chǎn)生,給人類和動(dòng)物的健康造成極大的威脅。因而,研究和篩選抗生素的替代品成為國(guó)內(nèi)外生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。在眾多研究中發(fā)現(xiàn),抗菌肽具有廣譜抗菌活性,對(duì)各種有害微生物、真菌、病毒的危害和腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生等均有很好的防控效果,而且很少產(chǎn)生耐藥性,因而受到國(guó)內(nèi)外研究者的高度青睞。藏豬又稱為藏香豬,是我國(guó)青藏高原上常年放牧生長(zhǎng)的寶貴地方品種,在長(zhǎng)期嚴(yán)酷的自然環(huán)境條件下,形成了珍貴的抗寒、抗病、食草、肉香等優(yōu)良特性,這些寶貴的優(yōu)良特性必然與其腸道特殊的微生物區(qū)系有關(guān),其腸道中存在的多種大量微生物群落相互拮抗又相互促進(jìn)共生,為藏豬腸道提供了優(yōu)良的微生態(tài)環(huán)境,分泌的各種維生素及多肽、蛋白等,發(fā)揮了促進(jìn)健康和預(yù)防疾病的功能,同時(shí),也為拮抗菌和抗菌物質(zhì)的篩選提供了來(lái)源。基于此,我們以藏豬腸道微生物為研究對(duì)象,采取多種現(xiàn)代先進(jìn)的生物技術(shù),研究藏豬腸道內(nèi)容物中是否存在拮抗病原菌的微生物,以及能否從篩選的拮抗菌中分離出有效的抑菌物質(zhì),如抗菌肽等。通過(guò)以下系列研究,獲得如下試驗(yàn)結(jié)果:1、采用瓊脂擴(kuò)散法從藏豬的盲腸內(nèi)容物中篩選出一株拮抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌活性最強(qiáng)的細(xì)菌,經(jīng)過(guò)對(duì)該菌株進(jìn)行菌落觀察、美藍(lán)染色鑒定以及16S rDNA的比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析,判定該菌株為枯草芽孢桿菌,并命名為Bacillus sublitis TS;發(fā)酵條件優(yōu)化分析表明,最佳碳源為2%的玉米粉,最佳發(fā)酵起始pH值為6,最佳培養(yǎng)溫度為30℃,接種后發(fā)酵至24h時(shí)其抑菌活性最高,抑菌物質(zhì)的產(chǎn)量最高。檢測(cè)發(fā)現(xiàn),該菌發(fā)酵上清液具有不耐熱、不耐蛋白酶K的特點(diǎn),而且在中性環(huán)境下,抑菌活性最高。2、采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)及反相液相色譜系統(tǒng),利用不同規(guī)格的反相液相色譜柱,包括ResourceTM RPC(3 mL)、Ultisil XB-C8、ZORBAX 300SB-C18色譜柱,結(jié)合超濾濃縮裝置,逐步將分離篩選的拮抗菌種Bacillus sublitis TS發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化,得到了一種新型的天然抗菌肽TP(Tibetan-swine derived peptide)。其質(zhì)譜分析表明,該純化抗菌肽包含16個(gè)氨基酸,序列為ASVVNKLTGGVAGLLK,分子質(zhì)量為1568.919 Da。在APD數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與其相同的氨基酸序列,因此命名為新型抗菌肽TP,在線預(yù)測(cè)顯示其帶有兩個(gè)正電荷,疏水性氨基酸比例為50%,等電點(diǎn)為10,分子式為C68H124N18O20S0。另外,TP的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果各異,可能形成螺旋結(jié)構(gòu),疏水氨基酸和親水氨基酸分別分布在螺旋結(jié)構(gòu)的兩面,也可能形成無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu),其確定的結(jié)構(gòu)形式仍需做進(jìn)一步的驗(yàn)證。3、采用MH瓊脂平板法,研究了抗菌肽TP對(duì)多種G+和G-細(xì)菌的抑制效果,結(jié)果以最小抑菌濃度(MIC)表示。研究結(jié)果表明,TP的敏感菌株多為革蘭氏陰性菌,陽(yáng)性菌的敏感性較弱。以E.coli ATCC 25922為模型,探究了抗菌肽TP對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)抑制的動(dòng)態(tài)作用效果。在一定范圍內(nèi),其作用時(shí)間越久,濃度越高,抑制效果越好,但對(duì)抑制大腸桿菌的傳統(tǒng)多肽多粘菌素相比活性仍然較弱。TP處理E.coli ATCC 25922后發(fā)現(xiàn):(1)在掃描電鏡下觀察,細(xì)胞表面完整性受到破壞;(2)鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)可以攝入細(xì)胞內(nèi),產(chǎn)生鄰-硝基苯酚(ONP),表明TP可以增強(qiáng)E.coli ATCC 25922的細(xì)胞膜滲透性;(3)滲出細(xì)胞外的K+濃度增加,進(jìn)一步證明了其滲透性增強(qiáng),細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞。另外,體外競(jìng)爭(zhēng)吸附試驗(yàn)表明,抗菌肽TP可以與EtBr競(jìng)爭(zhēng)E.coli ATCC 25922基因組DNA堿基結(jié)合位點(diǎn),結(jié)合力比EtBr對(duì)DNA的結(jié)合力更強(qiáng)。表明抗菌肽TP在殺菌過(guò)程中,增加細(xì)胞膜通透性,破壞膜結(jié)構(gòu),并有可能進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞,結(jié)合胞內(nèi)的DNA,使其DNA活性受阻。4、為檢驗(yàn)TP對(duì)紅細(xì)胞的毒性,采用細(xì)胞溶血性分析方法,檢驗(yàn)抗菌肽TP對(duì)小鼠紅細(xì)胞的毒性。結(jié)果表明,TP在320μM濃度下仍然有15%左右的溶血性,但與對(duì)照組PBS處理的溶血性相比差異不顯著,而極顯著低于1%Triton X-100處理后的溶血性(100%)(p0.01)。MTT分析結(jié)果表明,TP對(duì)原代絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的IC50=71.323μM的濃度比TP最敏感菌株的MIC(2.5 10μM)都要高。TP抑制人胃癌細(xì)胞系MKN-45和急性早幼粒白血病細(xì)胞系NB4的IC50濃度分別為4.686μM和11.479μM。NB4細(xì)胞使用TP處理后,提取RNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析,其癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax表達(dá)量上升,Bcl2表達(dá)量下降,表明TP處理后癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡癥狀。因而TP對(duì)紅細(xì)胞毒性小,對(duì)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞有輕微毒性,對(duì)癌細(xì)胞有抑制生長(zhǎng)作用。該試驗(yàn)結(jié)果可應(yīng)用于后續(xù)的臨床檢驗(yàn)和畜牧業(yè)生產(chǎn)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.6

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