本文關(guān)鍵詞：對(duì)蝦腸道菌群動(dòng)態(tài)平衡的免疫調(diào)控研究　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)是我國(guó)沿海地區(qū)重要的支柱產(chǎn)業(yè)。自上世紀(jì)90年代以來,對(duì)蝦養(yǎng)殖中疾病頻發(fā),使對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)屢受重創(chuàng)。為了解決困擾對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的疾病問題,科技工作者圍繞著宿主(對(duì)蝦的免疫防御)、病原(包括病原檢測(cè)、致病機(jī)理及防治)和環(huán)境(養(yǎng)殖環(huán)境的控制)三個(gè)方面做了大量的工作,也取得了很大的進(jìn)展。但疾病防治的問題始終沒有很好地解決,養(yǎng)殖中會(huì)不斷出現(xiàn)新的疾病。如果將宿主-病原-環(huán)境三個(gè)方面整合起來研究,有望發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖中疾病防控的新策略。對(duì)蝦腸道菌群的功能及其動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控的研究是將三者聯(lián)系起來的一個(gè)橋梁,因?yàn)閷?duì)蝦腸道菌群既與宿主免疫有關(guān),又與環(huán)境有關(guān)。因此,我們以日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)為材料,對(duì)腸道菌群動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)控進(jìn)行了研究。1.日本囊對(duì)蝦雙氧化酶參與腸道微生物群落動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控的研究腸道先天免疫反應(yīng)是抵抗外來病原的一種重要的防御機(jī)制。在果蠅的研究中,已知活性氧ROS和抗菌肽在清除腸道病原體中起到重要作用。然而,甲殼動(dòng)物是怎樣維持腸道菌群平衡的,現(xiàn)在還不清楚。我們?cè)谌毡灸覍?duì)蝦(M. japonicus)中克隆鑒定了一種雙氧化酶,命名為MjDUOX2。MjDUOX2是一種跨膜蛋白,N端在細(xì)胞外,含有一個(gè)19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和一個(gè)554個(gè)氨基酸的過氧化酶同源結(jié)構(gòu)域(Peroxidase homology domain, PHD);有7個(gè)跨膜域；細(xì)胞內(nèi)的部分含有3個(gè)EF結(jié)構(gòu)域(鈣離子結(jié)合域),一個(gè)104氨基酸的黃素腺嘌呤二核甘酸(Flavin adenine dinucleotide, FAD)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)156氨基酸的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。MjDUOX2和已報(bào)道的日本囊對(duì)蝦中的DUOX(命名為MjDUOX1)有較低的相似度(26.84%)。檢測(cè)兩種MjDUOX在日本囊對(duì)蝦中的組織分布,發(fā)現(xiàn)MjDUOXs的mRNA廣泛表達(dá)于血細(xì)胞、心臟、肝胰腺、鰓、胃和腸中。經(jīng)口感染弧菌后,腸道中MjDUOXs上調(diào)表達(dá),且活性氧(ROS)水平升高。通過RNA干擾(RNA interference, RNAi)的方法敲低MjDU OXs基因的表達(dá),腸道中ROS水平下降,細(xì)菌數(shù)量升高。利用RNA干擾技術(shù)敲降MjDUOXs的表達(dá)并感染病原菌后,對(duì)蝦存活率明顯下降。上述結(jié)果表明,能夠產(chǎn)生ROS的MjDUOXs在對(duì)蝦腸道菌群的動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控中發(fā)揮重要作用。2.日本囊對(duì)蝦過氧化氫酶降低活性氧ROS水平并參與腸道微生物的穩(wěn)態(tài)調(diào)控活性氧包括過氧化物、超氧陰離子和羥自由基等。作為一種強(qiáng)氧化劑,具有廣泛殺滅微生物作用,包括細(xì)菌、病毒和真菌等。近年來研究也發(fā)現(xiàn)活性氧在細(xì)胞的增生、分化、凋亡等的調(diào)控中也起重要作用,被認(rèn)為是一種新的第二信使。同時(shí)過量的活性氧也可以引發(fā)生物大分子及生物組織的氧化損傷。前面的研究發(fā)現(xiàn)DUOX可以在腸道細(xì)菌刺激的情況下產(chǎn)生活性氧,但對(duì)蝦腸道中多余的活性氧是如何清除還不了解。本研究中,我們從日本囊對(duì)蝦中克隆得到的一種過氧化氫酶(Catalase,CAT),并命名為MjCAT。利用半定量PCR方法檢測(cè)MjCAT的組織分布,結(jié)果顯示其mRNA在血細(xì)胞、心臟、肝胰腺、鰓、胃和腸中都有表達(dá)。經(jīng)口感染病原菌-弧菌后,腸道中蚴CAT的表達(dá)量上調(diào),酶活性升高,ROS含量在短時(shí)間內(nèi)上調(diào)并很快恢復(fù)。當(dāng)用RNAi方法將MjCAT基因表達(dá)敲低后發(fā)現(xiàn),ROS水平升高,并能保持較長(zhǎng)時(shí)間。同時(shí),對(duì)蝦腸道內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量與對(duì)照組相比明顯降低。干擾MjCAT并感染病原菌,對(duì)蝦存活率也顯著降低。觀察MjCAT干擾后對(duì)蝦腸道的組織結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)腸腔中絨毛受到損傷。這些結(jié)果表明,MjCAT可以調(diào)節(jié)腸道中ROS水平并調(diào)控宿主腸道與微生物間的穩(wěn)態(tài)。3.腸道菌群的識(shí)別與動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控的分子機(jī)理在果蠅的研究中,DUOX在保持腸道微生物動(dòng)態(tài)平衡過程中起到重要作用。但是宿主如何識(shí)別腸道菌群、并激活下游腸道菌群調(diào)控的信號(hào)途徑還不清楚。本研究中,我們首先對(duì)通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的5種G-蛋白偶聯(lián)受體(Guanosine-binding Protein Coupled Receptor, GPCR)進(jìn)行了篩選,得到了一種與MjDUOXs表達(dá)相關(guān)的GPCR,根據(jù)其結(jié)構(gòu)域組成命名MjMeGPCR。MjMeGPCR的表達(dá)進(jìn)行RNA干擾,顯示MjDUOXs的表達(dá)量減少,且ROS水平降低；過表達(dá)MjMeGPCR, MjDUOXs的表達(dá)量升高,且ROS含量升高。另外,MjMeGPCR可以與多種細(xì)菌結(jié)合。我們還對(duì)該信號(hào)途徑下游的分子包括活化轉(zhuǎn)錄因子-2 (Activating transcription factor-2,ATF2)和有絲分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK) p38 (Mjp38)進(jìn)行了研究。當(dāng)抑制細(xì)胞質(zhì)中Ca2+回流入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時(shí),ROS水平升高：當(dāng)抑制信號(hào)通路中的Mjp38活性或干擾MjATF2 時(shí),DUOX的表達(dá)量降低,ROS含量也降低。上述結(jié)果表明,腸道菌可以被MjMeGPCR所識(shí)別,通過p38和ATF2調(diào)控MjDUOXs的表達(dá)。此外并使Ca2+釋放,調(diào)控MjDUOXs的表達(dá)和活性,使腸道產(chǎn)生ROS,調(diào)控腸道菌群的平衡。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：1319306