本文關鍵詞：中國野生華東葡萄泛素連接酶基因VpPUB24功能研究　出處：《西北農林科技大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：葡萄是世界范圍內被廣泛栽培利用的重要果樹之一,特別是歐洲葡萄(Vitis vinifera L.),其品種在葡萄生產上占主導地位,既可用于鮮食,又可用于制汁,制干和釀酒等加工用途,具有良好的食用品質和商業(yè)價值,為人類創(chuàng)造了巨大經濟效益。但是,歐洲葡萄絕大多數(shù)品種不抗病,尤其是白粉病。我國是世界葡萄起源中心之一,擁有豐富的野生葡萄資源,其中,中國野生華東葡萄白河-35-1高抗葡萄白粉病。本研究以白河-35-1為材料,分離獲得U-box類型的泛素連接酶中與抗白粉病相關基因,分析基因結構,對基因表達模式與調控抗性功能進行研究,取得的主要結果如下:(1)采用RT-PCR技術檢測得到中國野生華東葡萄白河-35-1中56個U-box類型的泛素連接酶基因在接種白粉菌后表達情況,發(fā)現(xiàn)VpPUB24基因受白粉菌誘導表達。(2)采用RACE(Rapid amplification of cDNA ends)克隆技術獲得泛素連接酶VpPUB24的cDNA序列,VpPUB24全長為1457 bp,開放讀碼框1236 bp,編碼411個氨基酸,具有一個N端的U-box保守結構域和4個串聯(lián)的ARM保守結構域,其GenBank登錄號為:KU296025。同時還克隆了三個歐洲葡萄品種紅地球、赤霞珠和無核白葡萄中PUB24基因,比對分析發(fā)現(xiàn)VpPUB24氨基酸序列與三種歐洲葡萄中VvPUB24氨基酸序列一致性為100%。(3)克隆VpPUB24基因啟動子片段,并構建PVpPUB24-GUS融合載體,轉入農桿菌GV3101后瞬時轉化白河-35-1葡萄葉片后進行不同的生物和非生物脅迫處理,并進行啟動子GUS蛋白活性定量分析。結果表明VpPUB24基因受葡萄白粉菌、SA、MeJA及4℃低溫處理誘導表達。同時克隆了紅地球、赤霞珠和無核白葡萄中PUB24基因啟動子序列,通過PlantCARE網站分析表明歐洲葡萄PUB24啟動子中的一個P-box元件在華東葡萄白河-35-1葡萄中被一個TCA-element所取代。GUS組織化學染色試驗表明,不同葡萄中PUB24啟動子均受白粉菌和SA誘導表達,并且華東葡萄白河-35-1和三個歐洲葡萄品種PUB24啟動子受白粉菌和SA誘導表達情況存在一定差異。(4)構建中國野生華東葡萄白河-35-1的酵母cDNA文庫,通過酵母雙雜交技術篩選到VpPUB24蛋白的兩個互作蛋白VpICE1和VpEXO70B1。VpICE1是一個bHLH類型的轉錄因子基因,開放讀碼框為1551 bp,編碼516個氨基酸,其GenBank登錄號為:KU296026。VpEXO70B1是EXO70家族的基因,是胞外分泌復合體(Exocyst)的一個亞基,參與細胞胞吐和囊泡轉運,其具有一個EXO70保守結構域,開放讀碼框為1884 bp,編碼627個氨基酸,其GenBank登錄號為:KU507498。(5)通過雙分子熒光互補(Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC)和免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)試驗證明了VpPUB24與VpEXO70B1的互作關系。克隆了與VpPUB24基因序列一致性最高的VpPUB23基因,通過酵母雙雜交驗證明VpPUB23與VpEXO70B1蛋白不互作,說明VpPUB24與VpEXO70B1蛋白的互作具有特異性。通過煙草葉片瞬時表達系統(tǒng)證明了VpEXO70B1蛋白的降解受泛素化調控,VpPUB24促進VpEXO70B1蛋白降解。將VpPUB24基因穩(wěn)定整合到擬南芥后,發(fā)現(xiàn)VpPUB24基因通過調控水楊酸路徑上關鍵節(jié)點基因的表達,負調控對白粉菌的抗性。并通過亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)VpPUB24與VpEXO70B1蛋白的亞細胞定位受到SA的影響�？寺×巳A東葡萄白河-35-1、紅地球、赤霞珠和無核白葡萄中EXO70B1基因及啟動子,通過GUS組織化學染色分析表明,不同葡萄EXO70B1基因均受白粉菌和SA誘導表達。通過葡萄葉片瞬時表達試驗,證明了VpPUB24和VpEXO70B1基因通過調控SNC1、NPR1、PR1等基因的表達參與對葡萄白粉菌抗性的調控。(6)通過酵母雙雜交試驗證明了VpPUB24還與VpICE1互作,其C端的ARM結構域介導與VpICE1的C端ACT結構域互作;BiFC和Co-IP試驗也證明了VpPUB24與VpICE1蛋白互作。通過酵母雙雜交試驗發(fā)現(xiàn)VpPUB24也與葡萄中ICE家族的另外兩個成員VpICE2和VpICE3互作;進一步分析表明,VpICE1蛋白的降解受泛素化調控,但VpPUB24促進VpICE1蛋白的積累。還克隆了VpHOS1基因,通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補試驗證明了VpHOS1與VpICE1蛋白互作,蛋白降解試驗證明了VpHOS1促進VpICE1蛋白的降解,而VpPUB24通過抑制VpHOS1蛋白的積累促進VpICE1蛋白的積累。此外,還通過酵母雙雜交試驗證明了VpHOS1與VpPUB24蛋白在酵母中互作。通過轉基因擬南芥分析表明,VpPUB24通過調控ICE1-CBF/DREB1路徑相關基因表達正調控對低溫的抗性。綜上所述,中國野生華東葡萄白河-35-1泛素連接酶基因VpPUB24不僅能調控對低溫的抗性,而且還具有調控抗白粉病的功能。
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S663.1
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本文編號：1313552