發(fā)布時間：2017-12-20 04:09

  本文關(guān)鍵詞：綿羊血矛線蟲感染致皺胃微生物群落、血矛線蟲微生物群落及皺胃基因表達(dá)譜變化的病理生理學(xué)分析　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)是寄生于牛、羊等反會動物消化道的一種重要的寄生蟲,可引起感染動物貧血、消瘦甚至死亡,給畜牧業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。目前,對羊的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的防控主要依賴于抗蟲藥物。然而,該類藥物的頻繁使用導(dǎo)致產(chǎn)生了耐藥性蟲株,而逐漸被限制使用。再加上,捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的疫苗并不能像細(xì)菌或病毒疫苗那樣產(chǎn)生無菌免疫力。因此,很好的了解宿主與寄生蟲之間的相互作用有助于對該病制定有效防控策略及生產(chǎn)管理規(guī)范。除此之外,還有很多制約開展該類研究的因素需要我們解決。比如,尚無合適的方法防止DNA或RNA在提取過程中降解;尚無在最短的時間內(nèi)大規(guī)模從糞便中收集和純化卵囊或蟲卵的方法。目前已報道的大多數(shù)方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能解決這些瓶頸。本研究目的是探索宿主與寄生蟲之間的菌群種類及利用體內(nèi)或間接體內(nèi)系統(tǒng)揭示捻轉(zhuǎn)血矛線蟲在感染過程中蟲體分子生物學(xué)特性。特別強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是,我們對蟲卵的提取和純化、核酸的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化。就傳統(tǒng)的DNA或RNA提取方法而言,我們發(fā)現(xiàn)在裂解過程中核苷酸受到三重保護(hù)(如EDTA,SDS和NaCl),這個環(huán)境并不適宜RNase或DNase發(fā)揮作用。因此,完全去除RNA就要在DNA提完以后再加入RNase。同樣,提完RNA后加入DNase去除DNA污染。另外,我們利用電奶油分離器和真空過濾裝置收集和純化艾美耳球蟲卵囊和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲卵,其回收效率分別高達(dá)81%和92%,孢子化率(存活率)分別是68%和74%。處理12升糞便懸液只需要7.5分鐘。我們檢測了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲在早期和晚期感染過程中對皺胃和瘤胃菌群及宿主的影響。分離羊皺胃組織用于組織學(xué)和解剖學(xué)分析,并檢測胃液的PH值。微生物菌群用于16SrRNA測序。結(jié)果表明,捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染增加皺胃胃液的PH值(P=0.04953),引起前盲囊乳突數(shù)量大量增加(P=0.0463),并導(dǎo)致壞死和炎癥變化在急性感染階段更加嚴(yán)重。羊感染H.contortus7天,皺胃和瘤胃菌群分別有98%和94%的細(xì)菌發(fā)生顯著變化(P = 0.0369-0.0495)。然而,感染50天以后,菌群變化分別是 62%和69%(P = 0.0369-0.0495)。本研究利用Illumina MiSeq平臺探索H.contortus在不同生活史階段菌群的變化,擴(kuò)增區(qū)域是V3-V4,和V5-V7區(qū)。V3-V4測序結(jié)果表明,H contortus菌群包括48個屬,而V5-V7測序結(jié)果有 28 個屬。優(yōu)勢菌分別是Escherichia-Shigella,Pseudomonas and Ochrobctrum,存在于線蟲生活史的所有階段。羊皺胃組織采自H.contortus感染后7天和50天,用于轉(zhuǎn)錄組測序�；贗lluminaHi Seq 4000平臺的測序結(jié)果顯示,與對照組相比,感染組在第7天有548個基因上調(diào)表達(dá),有301個基因下調(diào)表達(dá),50天感染組與7天感染組相比,有357個基因上調(diào)表達(dá),355個基因下調(diào),與對照組相比只有7個基因上調(diào)表達(dá),11個基因下調(diào)表達(dá)。該結(jié)果表明,H.contortus.在感染早期與晚期相比更有效地激活皺胃基因的表達(dá)。為了研究H.contortus幼蟲階段入侵羊粘膜激發(fā)的直接免疫應(yīng)答,我們建立了一個間接體內(nèi)胃底粘膜模型來模仿體內(nèi)不同細(xì)胞間的作用過程,來探索捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染早期基因表達(dá)情況。分離羊皺胃用于組織學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,上清液用于測定乳酸脫氫酶(LDH)的活性。免疫應(yīng)答關(guān)鍵基因包括 IL-6,IL-8,C1q,CXCR-3,CXCL-2,超氧化物岐化酶,ITGA7/8/9,ITGB1,ITGB6,ICAM-1和Actin1表達(dá)水平發(fā)生變化。綜之,上述結(jié)果表明,捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染對胃菌群的組成、多樣性起到重要作用,線蟲體內(nèi)的菌群也反映了外部的微生物。此外,galectins可以被看作是宿主在H.contortus不同感染階段發(fā)揮免疫調(diào)控作用的分子。本研究完全拓展了我們對宿主羊和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的微生物群的理解,及H.contortus感染即時期、早期和晚期羊胃基因表達(dá)情況,并改進(jìn)了一些寄生蟲學(xué)研究方面的技術(shù),如卵的收集與純化,核苷酸提取,這對后期研究提供重要的應(yīng)用價值。此外,H.contortus誘導(dǎo)劑可引起防御相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá),并引發(fā)炎性反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答。本研究展示了已經(jīng)取得的研究成果,以期為胃腸道寄生蟲的防控提供應(yīng)用價值。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S858.26

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Nilusha Malmuthuge;Le Luo Guan;;Understanding host-microbial interactions in rumen:searching the best opportunity for microbiota manipulation[J];Journal of Animal Science and Biotechnology;2017年02期

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本文編號：1310685