本文關鍵詞：新孢子蟲ROP5和ROP16的功能及作用機制

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【摘要】：犬新孢子蟲(Neospora canium)為頂復亞門原蟲,主要引起牛的流產(chǎn)和犬的神經(jīng)系統(tǒng)機能障礙。與弓形蟲、瘧原蟲等其它頂復亞門原蟲相比,關于新孢子蟲蛋白功能和致病機制的研究報道較少。本研究擬開展新孢子蟲棒狀體蛋白(ROP)的研究,希望解析幾種ROP的功能和作用機制。頂復亞門原蟲的ROP種類很多,多種ROP在蟲體生命活動中具有重要功能,弓形蟲和瘧原蟲的有些ROP已經(jīng)被確定為重要的毒力因子。目前對于新孢子蟲的ROP研究報道較少,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)新孢子蟲ROP18是假基因,分析發(fā)現(xiàn)ROP5和ROP16能在蟲體內正常表達,作者擬對新孢子蟲的ROP5和ROP16進行系統(tǒng)研究。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)新孢子蟲ROP5在基因組中存在三個重復拷貝,預測其有1個蛋白激酶結構域。利用同源重組技術構建新孢子蟲ROP5基因缺失蟲株(△ROP5),及其基因回補蟲株(△ROP5-cm)。對ROP5各基因調控蟲株與母源蟲株比較研究顯示,AROP5的入侵和噬斑形成能力減弱,增殖速度減慢。BALB/c小鼠腹腔接種1×106△ROP5蟲株小鼠的腦荷蟲量降低,3×106AROP5對小鼠的致病力下降,ROP5是影響新孢子蟲致病力的重要因子。進一步的比較研究發(fā)現(xiàn),AROP5的GRA7轉錄下調,ROP17轉錄上調,且△ROP5蟲株的GRA7不能定位于納蟲空泡膜,ROP17彌散分布于蟲體胞質。各基因調控蟲株能刺激機體產(chǎn)生IFN-γ繼而誘導細胞免疫因子GBP1、GBP2、IRGb6和IRGd的表達,但是AROP5接種后引起GBP1、GBP2和IRGb6表達量比其它蟲株接種的細胞低。與母源蟲株相比,AROP5接種巨噬細胞Raw246.7后GBP1和GBP2向納蟲空泡膜上的聚集能力增強約40%,說明蟲體更容易被免疫細胞殺傷,初步證明ROP5通過調節(jié)GBP1和GBP2等細胞自主免疫途徑介導新孢子蟲的免疫逃避。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)新孢子蟲能磷酸化宿主細胞STAT3,但發(fā)生機制尚不可知。我們分析發(fā)現(xiàn)ROP16含有保守的核定位信號和磷酸激酶結構域,KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)ROP16的下游分子為STAT3。為了明確ROP16與蟲體磷酸化宿主細胞STAT3之間的關系,我們構建了 ROP16基因缺失蟲株(AROP16)、回補蟲株(△ROP16-cm)和過表達蟲株(ROP16-oe)。對各基因調控蟲株進行比較研究,與母源蟲株相比,AROP16的噬斑形成能力和增殖能力減弱,△ROP16-cm和ROP16-oe增強。將各蟲株接種BALB/c小鼠30d后,發(fā)現(xiàn)△ROP16接種組小鼠腦荷蟲量降低,AROP16-cm和ROP16-oe組小鼠腦荷蟲量顯著增加;AROP16接種組小鼠死亡率降低,ROP16-oe組小鼠死亡率升高。表明ROP16是新孢子蟲發(fā)揮致病作用的重要因子。我們還發(fā)現(xiàn)與表達ROP16的蟲株相比,△ROP16感染宿主細胞24 h后STAT3的磷酸化水平減弱;pcDNA3.1-NcROP16轉染HEK293T細胞后能磷酸化細胞STAT3,進一步說明ROP16促進新孢子蟲對宿主細胞STAT3的激活。我們對ROP16核定位信號和磷酸激酶結構域突變體的研究顯示,mutROP16NLS不能進入宿主細胞核,mutROP16PKc不能磷酸化細胞STAT3,說明核定位信號是ROP16進入宿主細胞細胞核的關鍵結構,磷酸激酶結構域是在其發(fā)揮磷酸化功能的過程中起決定作用;對ROP16各基因調控蟲株誘導巨噬細胞ANA1的凋亡進行檢測發(fā)現(xiàn),△ROP16感染組的細胞凋亡率顯著降低,說明新孢子蟲ROP16促進了宿主細胞的凋亡。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.7

【參考文獻】

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本文編號：1306318