本文關(guān)鍵詞：豬GPR120基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制及miR-25對肌肉細胞能量代謝的抑制作用研究

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【摘要】：能量代謝是動物生長、生產(chǎn)、繁育等重要生命活動的基礎(chǔ);同時與人類代謝綜合癥等息息相關(guān)。因此,對能量代謝調(diào)控進行研究不僅有助于提高動物生產(chǎn)經(jīng)濟效益同時對于改善人類健康也具有重大的意義。在本課題組前期的研究中,通過對大白豬的組織表達譜分析,發(fā)現(xiàn)GPR120是差異表達基因。GPR120基因參與能量平衡的多個生理過程,調(diào)節(jié)全身性能量和營養(yǎng)代謝平衡。本研究擬對GPR120基因進行研究,分析研究GPR120基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制,揭示GPR120基因在能量代謝調(diào)控過程的作用。本研究還基于胚胎期大白豬和通城豬的背最長肌組織的Solexa測序獲得miR-25,通過分析miR-25序列,預測靶基因并進行功能分析驗證;同時對miR-25的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制進行初步研究,探尋轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)miR-25轉(zhuǎn)錄的分子機制。主要研究結(jié)果如下:1.豬GPR120基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究基于預測的啟動子區(qū)域CpG島分布情況構(gòu)建GPR120基因啟動子區(qū)域的缺失片段雙熒光素酶載體,雙熒光結(jié)果顯示缺失片段P5(-323/+165)是GPR120基因核心啟動子區(qū)域。使用TFSEARCH ver.1.3網(wǎng)站預測GPR120基因核心啟動子區(qū)域中有與能量代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ的結(jié)合位點(TGTCG);而且在人、小鼠和豬三個物種,GPR120啟動子區(qū)域中的C/EBPβ結(jié)合位點高度保守。通過定點突變實驗證明轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ結(jié)合位點的突變顯著地抑制了GPR120啟動子的轉(zhuǎn)錄活性;而且通過ChIP實驗表明,在體內(nèi)環(huán)境中,轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ可以與GPR120基因核心啟動子結(jié)合。超表達C/EBPβ顯著性促進了GPR120和PPARγ基因的表達;而干涉C/EBPβ的表達則顯著性抑制了GPR120基因的表達。此外,我們的實驗結(jié)果還表明,高能飼喂(HFD-feeding)能夠促進小鼠脂肪組織中GPR120,C/EBPβ和PPAR-γ2基因的表達,并且能夠增強轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ與GPR120基因啟動子區(qū)域的結(jié)合能力。2.miR-25在肌肉細胞能量代謝中的作用對C2C12成肌細胞進行成肌誘導分化,檢測結(jié)果表明:小鼠miR-25-3p的表達量在C2C12成肌細胞分化過程中呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的變化趨勢。在轉(zhuǎn)染miR-25-3p mimics的實驗組中,檢測結(jié)果表明肌肉細胞能量代謝的標志基因PI3K、Map2k4的表達水平顯著下降。運用多種miRNA靶基因預測生物信息學網(wǎng)站預測miR-25-3p靶基因,發(fā)現(xiàn)Akt1基因的3’UTR區(qū)域有miR-25-3p的結(jié)合位點,而且序列比對分析發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中Akt1基因的miR-25靶位點序列具有高度的保守性。雙熒光結(jié)果顯示,miR-25-3p顯著地抑制了Akt1-3’UTR的熒光活性,說明miR-25-3p能夠識別Akt1基因的3’UTR上的miR-25-3p靶位點并與其發(fā)生特異性結(jié)合。超表達miR-25-3p可以顯著性下調(diào)Akt1和PI3K基因的mRNA表達水平;與此同時,miR-25-3p的超表達導致了Akt1和PI3K蛋白表達水平的下降�？傊�,miR-25-3p可以靶向基因Akt1,并抑制Akt1在mRNA和蛋白水平上的表達,進而可能影響PI3K/Akt信號通路的活化,調(diào)節(jié)肌肉細胞的能量代謝過程。3.小鼠miR-25轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的研究本研究中,我們克隆了小鼠miR-25-3p的5′端上游區(qū)域2034 bp序列并構(gòu)建miR-25-3p啟動子區(qū)域缺失片段熒光載體,熒光活性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),缺失片段miR-25-3p-P9(-119/+144)是miR-25的核心啟動子區(qū)域。使用生物信息學網(wǎng)站對miR-25核心啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件進行預測分析,發(fā)現(xiàn)一個潛在的轉(zhuǎn)錄因子AP-2α結(jié)合位點。定點突變實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子AP-2α結(jié)合位點的突變顯著地抑制了miR-25啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。通過ChIP-Q-PCR實驗證明:在體內(nèi)環(huán)境中,轉(zhuǎn)錄因子AP-2α可以與miR-25啟動子發(fā)生特異性地結(jié)合。而且通過ChIP-Q-PCR實驗證明與C2C12細胞分化第8 d相比,轉(zhuǎn)錄因子AP-2α與miR-25啟動子在C2C12細胞分化第0 d時結(jié)合能力更強。超表達AP-2α可以顯著促進miR-25啟動子的活性;而且超表達AP-2α可以顯著性提高miR-25的mRNA表達量,同時也可以下調(diào)miR-25靶基因Akt1的mRNA和蛋白表達水平;與此一致,干涉AP-2α的表達顯著性抑制了miR-25的mRNA表達量,同時也提高了基因Akt1的mRNA和蛋白表達量。上述實驗結(jié)果證明AP-2α在miR-25轉(zhuǎn)錄過程中有著重要的調(diào)控作用,并且能夠識別miR-25核心啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子AP-2α結(jié)合位點,而且同時還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子AP-2α對miR-25靶基因Akt1的表達有抑制作用。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S828

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