本文關(guān)鍵詞：玉米與其近緣種屬間多倍體雜種的合成和遺傳學(xué)研究

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【摘要】：植物種屬間的雜交和多倍化是高等植物形成和進(jìn)化的重要驅(qū)動(dòng)力。多倍化導(dǎo)致核基因組的聚變,常會(huì)帶來新的性狀變異,使其更適合育種選擇和自身發(fā)展需要。自然界中多倍體分布廣泛,但較長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)化歷程以及模糊的親緣關(guān)系,限制了對(duì)其進(jìn)一步的研究應(yīng)用。人工合成的多倍體因親緣關(guān)系明晰和較短的進(jìn)化歷程而備受關(guān)注。玉米近緣野生材料大芻草和摩擦禾是自然保留下來的重要遺傳材料,通過雜交和多倍化等途徑創(chuàng)造新的種質(zhì)資源,并對(duì)合成的多倍體雜種的遺傳學(xué)規(guī)律進(jìn)行探討,將對(duì)玉米遺傳改良和多倍體合成具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究在遠(yuǎn)緣雜交和加倍合成系列玉米、大芻草和摩擦禾多倍體雜種的基礎(chǔ)上,利用解剖學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù),分析不同親本基因組組成、不同細(xì)胞質(zhì)組成以及不同倍性對(duì)合成的多倍體表型、染色體、基因組、序列以及后代染色體的組成的影響。研究結(jié)果如下：1以玉米(MM20(M),2n=20).四倍體多年生大芻草(9475(P),2n=40)和四倍體指狀摩擦禾(TZ07(T),2n=72)為親本合成了系列兩物種或三物種間的多倍體材料。即MM20同源加倍產(chǎn)生的同源四倍體(MM40),染色體組成為2n=40M;MM20與MM40雜交產(chǎn)生的同源三倍體(MM30),染色體組成為2n=30M;MM20與9475正反交產(chǎn)生的異源三倍體(MP30和PM30),染色體組成為2n=10M+20P;MM40與9475正反交產(chǎn)生的異源四倍體(MP40和PM40),染色體組成為2n=20M+20P;玉米、9475和摩擦禾雜交產(chǎn)生的異源六倍體MTP74(MMTTPP),染色體組成為2n=20M+20P+34T；MTP74與9475回交產(chǎn)生的異源八倍體MTP94(MMTTPPPP),染色體組成為2n=20M+40P+34T.分析表明,同源三倍體、同源四倍體以及異源四倍體的染色體條數(shù)在不同的個(gè)體中產(chǎn)生波動(dòng)；高倍性的MTP74和MTP94是通過遠(yuǎn)緣雜交結(jié)合2n+n有性生殖加倍的方式形成的異源多倍體,兩個(gè)異源多倍體營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛,多年生,可以通過無性繁殖擴(kuò)繁,二者的染色體條數(shù)并未隨著擴(kuò)繁和種植年限增加而改變。2通過形態(tài)解剖和顯微測(cè)量技術(shù),對(duì)合成的多倍體的氣孔、花粉和細(xì)胞核以及DNA含量進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明,氣孔大小隨著倍性的增加而增大,具有“多倍化效應(yīng)”,并且受遠(yuǎn)緣雜交和不同細(xì)胞質(zhì)組成的影響。然而,花粉粒和細(xì)胞核的大小與遠(yuǎn)緣雜交、倍性以及不同細(xì)胞質(zhì)組成的相關(guān)性較小。DNA含量的增加與倍性有關(guān),但是DNA含量的丟失主要受遠(yuǎn)緣雜交、倍性和不同細(xì)胞質(zhì)的綜合影響。氣孔、花粉、細(xì)胞核、DNA含量以及多倍體親本染色體數(shù)的相關(guān)性分析表明,氣孔的大小與三親本染色體的多少呈顯著正相關(guān),細(xì)胞核的大小與摩擦禾染色體的多少呈顯著正相關(guān)�；ǚ坌誀钆cDNA含量無關(guān),但花粉面積和花粉體積與玉米染色體數(shù)呈顯著正相關(guān),花粉長(zhǎng),花粉寬和花粉面積與摩擦禾染色體數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)。3為了更好的對(duì)多倍體三親本染色體組成結(jié)構(gòu)以及后續(xù)的多倍體有絲分裂和減數(shù)分裂染色體行為進(jìn)行研究,采用基因組原位雜交(GISH)和熒光原位雜交(FISH)相結(jié)合對(duì)三親本染色體同源性進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明,玉米與9475染色體基因組相互雜交能夠產(chǎn)生較強(qiáng)信號(hào),二者的同源性較高;玉米與摩擦禾基因組相互雜交僅在異染色質(zhì)紐(Knob)區(qū)域產(chǎn)生信號(hào),具有同源性,二者的能夠在該區(qū)域相互雜交：9475與摩擦禾同樣在Knob區(qū)域具有同源性,但二者基因組的相互雜交中,僅在摩擦禾DNA雜交9475的染色體上產(chǎn)生Knob信號(hào),9475DNA雜交摩擦禾染色體上并沒有檢測(cè)出Knob言號(hào)。綜合表明,三親本中摩擦禾是較原始的種,與玉米和9475染色體僅在染色體末端Knob區(qū)域具有同源性,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；玉米和9475同屬,親緣關(guān)系較近。4采用雙色GISH對(duì)異源四倍體MP40和異源多倍體MTP74有絲分裂各時(shí)期的染色體行為和分布進(jìn)行研究。結(jié)果表明,二者有絲分裂過程穩(wěn)定,在各時(shí)期并無染色體滯后,染色體橋或染色體不均衡分離等異常染色體的情況出現(xiàn),三親本染色體也沒有在有絲分裂過程中產(chǎn)生獨(dú)立區(qū)域,而是彼此交融在一起。5采用品紅染色法和雙色GISH對(duì)親本及其合成的系列多倍體減數(shù)分裂行為和穩(wěn)定性進(jìn)行分析。研究表明,玉米和9475基因組內(nèi)的A和B亞基因組部分染色體存在同源性,并且在9475細(xì)胞中B1和B2亞基因組同樣存在一定的同源性,其染色體的基數(shù)為5。摩擦禾的染色體組成可能與9475類似,為XXX'X'Y1Y1Y2Y2,并且染色體基數(shù)可能為9。對(duì)多倍體的價(jià)體分析表明,玉米與9475組成的雜合價(jià)體數(shù)量最高,并且玉米A亞基因組中有10條染色體可能與9475A亞基因組中的20條染色體具有同源性；在MTP74和MTP94中存在少量摩擦禾與玉米和9475的雜合價(jià)體,表明它們之間存在部分的同源性。對(duì)多倍體減數(shù)分裂染色體紊亂與育性相關(guān)分析表明,多倍體的減數(shù)分裂紊亂程度與育性并無相關(guān)性；對(duì)多倍體減數(shù)分裂受到的影響因素分析表明,多倍體減數(shù)分裂的穩(wěn)定性受倍性、外緣親本加入和不同細(xì)胞質(zhì)組成的影響。對(duì)同源多倍體和異源多倍體減數(shù)分裂的穩(wěn)定性比較表明,同源多倍體減數(shù)分裂的穩(wěn)定性低于異源多倍體,緣于玉米異源多倍體中親本部分染色體有限的同源性。對(duì)異源多倍體中不同親本的減數(shù)分裂穩(wěn)定性分析表明,玉米的減數(shù)分裂穩(wěn)定性在所有的多倍體中均低于9475；在三物種多倍體MTP74和MTP94中,摩擦禾染色體穩(wěn)定性最高；說明摩擦禾染色體與其他兩個(gè)親本的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),而保持自身染色體的穩(wěn)定性。6利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性AFLP技術(shù)對(duì)合成的多倍體以及它們的親本共計(jì)9份材料進(jìn)行多倍體合成早期基因組變化的分析。篩選的16對(duì)AFLP引物中共擴(kuò)增出635條清晰條帶。三親本條帶分析表明,三親本既有特異的條帶,同時(shí)具有共同條帶,其中摩擦禾的特異條帶最多,為102個(gè),9475最少,為32個(gè)。玉米與9475共有條帶為164個(gè),玉米與摩擦禾共有條帶為64個(gè),9475與摩擦禾共有條帶為32個(gè)。三親本共有條帶為154個(gè)。對(duì)三親本進(jìn)行聚類分析表明,玉米在基因組一級(jí)結(jié)構(gòu)上與9475同源性最高,而摩擦禾在基因組一級(jí)結(jié)構(gòu)上與9475的同源性最高,結(jié)果與系統(tǒng)分類相符。對(duì)多倍體的AFLP條帶分析表明,多倍體對(duì)親本條帶以繼承為主,但是所有的多倍體中均產(chǎn)生丟失條帶,條帶的丟失與倍性的增加關(guān)系較少,而與基因組內(nèi)親本的同源性高低有關(guān)。對(duì)多倍體丟失的條帶分為特異條帶和共有條帶分析表明,多倍體基因組中傾向丟失特異條帶；將丟失的條帶分為不同親本類型分析表明,多倍體基因組中傾向丟失玉米類型的條帶。7利用特定序列單克隆測(cè)序技術(shù)和熒光原位雜交(FISH)定位分析技術(shù)對(duì)多倍體序列的演化進(jìn)行研究。利用FISH技術(shù),以標(biāo)記的centc序列、45SrDNA序列和5SrDNA序列作探針,研究了多倍體和親本的根尖體細(xì)胞中期染色體雜交信號(hào)的分布特點(diǎn)。研究結(jié)果表明,多倍體著絲粒上的centc序列隨著倍性的增加和外緣親本的加入而改變,主要體現(xiàn)在部分染色體centc信號(hào)的降低；而45S和5S序列在染色體上的位置和個(gè)數(shù)并沒有發(fā)生明顯的改變。選取存在于45S中的ITS序列對(duì)多倍體ITS序列變異分析表明,多倍體中隸屬于不同親本的ITS序列長(zhǎng)度和GC含量的改變較小,ITS序列的變異主要體現(xiàn)為位點(diǎn)的變異,位點(diǎn)變異在三親本中均發(fā)生,并受到遠(yuǎn)緣雜交、倍性以及細(xì)胞質(zhì)的多重影響。多倍體中ITS序列的變異具有親本的傾向性,其中9475親本類型的ITS序列產(chǎn)生的變異位點(diǎn)最多。多倍體ITS序列的信息位點(diǎn)分析表明,ITS信息位點(diǎn)在多倍體中發(fā)生協(xié)同進(jìn)化,協(xié)同進(jìn)化主要發(fā)生在玉米和9475ITS信息位點(diǎn)中,進(jìn)化程度受多倍體細(xì)胞核中親本基因組組成、細(xì)胞質(zhì)、倍性和遠(yuǎn)緣雜交的影響；摩擦禾ITS序列在MTP74和MTP94中所占比例較小,其本身ITS序列信息位點(diǎn)并沒有受到其他兩個(gè)親本的影響,但摩擦禾ITS序列能夠?qū)ζ渌麅蓚�(gè)親本的ITS序列產(chǎn)生影響。8以MTP74和MTP94為母本、9475為父本進(jìn)行回交,獲得了兩個(gè)回交群體,采用雙色GISH的方法,對(duì)兩個(gè)回交群體植株的染色體數(shù)目、組成等進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明,MTP74與9475回交獲得21個(gè)回交后代植株,后代群體的染色體數(shù)目在37-82之間,呈現(xiàn)三種不同的生殖方式,分別為單倍體生殖n,正常生殖n+n和無融合生殖2n+n；其中,單倍體生殖n和無融合生殖2n+n各一例,其余19個(gè)為n+n方式；n+n方式產(chǎn)生的回交后代中含玉米、9475和摩擦禾的染色體數(shù)目范圍分別為7-13條,26-33條和4-20條,平均數(shù)分別為10.32條、29.42條和16.32條。MTP94與9475回交獲得19個(gè)回交后代,后代群體的染色體范圍在47-87之間,呈現(xiàn)三種不同的生殖方式,分別為單倍體生殖n,正常生殖n+n和雙受精n+n+n；其中,單倍體生殖n和雙受精n+n+n各一例,其余17個(gè)為n+n方式;n+n方式產(chǎn)生的回交后代中含玉米、9475和摩擦禾的染色體數(shù)目范圍分別為8-16條,30-41條和14-18條,平均數(shù)分別為11.11條、37.94條和16.24條。對(duì)兩個(gè)群體中不同個(gè)體親本染色體數(shù)的變異程度分析表明,兩個(gè)群體種玉米染色體數(shù)的變異程度最大。二者間比較表明,MTP94群體僅有摩擦禾染色體數(shù)的變異程度小于MTP74群體,其它他均大于MTP74群體。對(duì)兩個(gè)群體的染色體結(jié)構(gòu)變異分析表明,兩個(gè)回交群體中均出現(xiàn)染色體易位現(xiàn)象,其中MTP74群體和MTP94的易位頻率分別為2.63%和1.720%,易位主要發(fā)生在玉米和9475染色體之間,摩擦禾與兩個(gè)親本染色體之間的易位較少。對(duì)多倍體減數(shù)分裂和后代染色體組成相關(guān)性分析表明,多倍體減數(shù)分裂中親本染色體紊亂系數(shù)與回交后代親本染色體組成的變異程度呈極顯著正相關(guān),多倍體減數(shù)分裂中玉米和9475染色體的異源聯(lián)合與后代玉米和9475染色體的易位呈極顯著正相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S513

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本文編號(hào)：1302087