本文關(guān)鍵詞：捕食性真菌Duddingtonia flagrans全基因組測序及基于轉(zhuǎn)錄組分析的捕食相關(guān)基因研究

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【摘要】：Duddingtonia flagrans是捕食線蟲性真菌的一個代表種類,強大的環(huán)境耐受力與捕食線蟲能力使它在動物寄生性線蟲防治方面具有不可比擬的優(yōu)勢。國內(nèi)外科學(xué)家針對Duddingtonia flagrans做了大量的研究工作,內(nèi)容貫穿形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)觀察、生物學(xué)特性研究與臨床殺蟲效果評價。但是由于缺乏分子水平研究基礎(chǔ),直到目前,我們還無法從基因與進化角度說明其對線蟲的致病力與生存能力,這可能是制約捕食線蟲性真菌研究領(lǐng)域發(fā)展的一個重要原因。為此,本研究以捕食線蟲性真菌Duddingtonia flagrans為研究對象,在國內(nèi)外首次對其進行了全基因組測序與轉(zhuǎn)錄組測序,通過比較基因組學(xué)分析,揭示其基因組特征、腐生能力、致病能力、起源與進化特點;利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,篩選一系列與捕食線蟲功能相關(guān)的基因,并對其進行熒光定量PCR驗證;借助于光學(xué)顯微鏡及掃描電子顯微鏡,對Duddingtonia flagrans捕食寄生性線蟲三期幼蟲過程,進行了詳盡的觀察與描述;利用活體熒光染色技術(shù),對Duddingtonia flagrans原生質(zhì)體的制備進行了評價,為捕食線蟲相關(guān)基因的功能驗證提供了基礎(chǔ)研究材料。主要取得的研究成果有以下幾個方面:(1)對D.flagrans基因組DNA提取方法進行了篩選與優(yōu)化,結(jié)果表明透析膜培養(yǎng)結(jié)合柱式法提取其基因組DNA的方法簡便可行,為絲狀真菌DNA提取提供了新的思路;利用低深度二代測序技術(shù),對D.flagrans的基因組概況進行了評估,結(jié)果表明D.flagrans基因組大小約為37.6 Mb,GC含量為44.95%,基因組雜合度較低,可以采用常規(guī)方法對其進行深度測序與組裝,該研究為D.flagrans全基因組精細圖譜繪制方案的制定提供了重要依據(jù)。(2)在對D.flagrans進行三代高深度測序的基礎(chǔ)上,利用比較基因組學(xué)分析對D.flagrans基因組特征、腐生能力以及對線蟲的致病性進行了分析。結(jié)果顯示,D.flagrans基因組較小,并且缺乏重復(fù)誘導(dǎo)點突變機制,顯示了其緩慢的進化速率。同時,同源基因分析和基因家族分析表明D.flagrans基因組變異不明顯、保守性較強。致病性分析表明,D.flagrans具有豐富的潛在致病基因,這些基因在線蟲捕食過程中發(fā)揮重要作用,包括PHI基因,細胞色素P450基因,以及數(shù)量眾多的蛋白酶編碼基因。與之相反,D.flagrans中碳水化合物降解酶基因數(shù)量較少,表明D.flagrans利用碳水化合物的能力較弱,反映出D.flagrans較弱的腐生能力。(3)對捕食線蟲性真菌D.flagrans捕食馬圓線蟲屬幼蟲過程進行了超微形態(tài)學(xué)觀察,進一步深入認識了該真菌與線蟲相互作用的過程;通過實時動態(tài)觀察,將整個捕食過程劃分為三個階段,分別為捕食前(0h)、捕食中(12 h)、捕食后(48 h),不同捕食階段的劃分為后續(xù)D.flagrans轉(zhuǎn)錄組研究樣品采集工作提供了理論依據(jù),也為D.flagrans捕食相關(guān)基因的發(fā)掘奠定了理論基礎(chǔ)。(4)以D.flaagrans基因組為參考,對D.flagrans捕食線蟲的不同階段樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序,結(jié)果表明,D.flagrans在捕食線蟲過程中,共有41.2%的基因發(fā)生差異表達,其中上調(diào)表達基因有2877個,下調(diào)表達基因有3269個;對差異表達基因進行GO功能富集分析表明,在真菌捕食線蟲過程中,參與能量代謝、擴膜轉(zhuǎn)運的相關(guān)基因產(chǎn)生了顯著表達,這些基因與真菌在捕食線蟲時大量分泌胞外蛋白酶以及能量的產(chǎn)生有關(guān);KEGG富集分析表明,上調(diào)基因中,次級代謝產(chǎn)物合成途徑富集的基因數(shù)目最多,說明次級代謝產(chǎn)物在真菌侵染線蟲過程中發(fā)揮了重要作用;下調(diào)基因中淀粉與蔗糖代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、過氧物酶體、碳代謝過程富集的基因數(shù)目多,說明與真菌腐生作用相關(guān)的碳水化合物降解作用減弱;對捕食過程中分泌蛋白酶調(diào)控基因分析與前100位差異表達基因統(tǒng)計分析表明,在真菌捕食線蟲時,參與捕食功能的凝集素、幾丁質(zhì)酶、枯草桿菌蛋白酶、G蛋白偶聯(lián)受體、MAPK信號通路、細胞骨架構(gòu)建等相關(guān)基因等基因高水平表達,而與腐生有關(guān)的碳水化合物降解酶基因呈下調(diào)表達趨勢。(5)以轉(zhuǎn)錄組分析中篩選的與捕食線蟲功能相關(guān)的基因為基礎(chǔ),挑選了其中22種對于捕食功能具有重大意義的目的基因,并進行熒光定量PCR驗證,結(jié)果顯示,11種上調(diào)表達基因與11種下調(diào)表達基因表達趨勢均符合轉(zhuǎn)錄組分析所得數(shù)據(jù),驗證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性,并進一步證明了這些基因參與了D.flagran 捕食線蟲過程。(6)為了對篩選的捕食線蟲相關(guān)基因進行功能驗證,為目的基因敲除提供試驗材料—D.flagrans原生質(zhì)體,本研究利用熒光探針CFDASE,對D.flagrans原生質(zhì)體制備情況進行快速評估,探究了 CFDASE標(biāo)記原生質(zhì)體的最佳條件,結(jié)果顯示,CFDASE終濃度為10μmol/L、標(biāo)記時間為15 min、孵育溫度為36℃為標(biāo)記最佳條件。該結(jié)果為捕食線蟲性真菌D.flagrans原生質(zhì)體的大量制備提供了快速評價方法,為捕食相關(guān)基因功能驗證提供了基礎(chǔ)試驗材料。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S855.9;Q78

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本文編號：1301426