本文關(guān)鍵詞：MBF2家族鑒定及其成員MBF2-1參與絲素重鏈轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究

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【摘要】：家蠶能成為重要的經(jīng)濟昆蟲,主要原因在于其可以分泌蠶絲。蠶絲是由家蠶高度特化的器官-絲腺合成分泌的。根據(jù)絲腺各區(qū)段的結(jié)構(gòu)形態(tài)不同,將絲腺分成前部、中部及后部絲腺。絲的兩大組成部分—絲素和絲膠,分別是由后部絲腺及中部絲腺合成。其中,絲素是蠶絲的主要組成部分,它由絲素重鏈蛋白、絲素輕鏈蛋白及P25蛋白組成的多聚體蛋白。絲蛋白的表達不僅具有組織特異性,還具有明顯的時期特異性。絲蛋白在幼蟲前幾個齡期合成少量絲蛋白,主要用于眠期時,將自己固定在蠶座上,以便蛻皮。絲蛋白只有在幼蟲最后一齡末期才被大量合成。先前研究表明,絲蛋白的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平,并且絲蛋白的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在每齡盛食期,在眠期則不再轉(zhuǎn)錄。雖然研究學(xué)者對絲腺高效的蛋白合成能力和基因表達的調(diào)控機制進行了持續(xù)的研究,但是目前只有少量的絲蛋白轉(zhuǎn)錄因子被鑒定,絲蛋白的高效特異表達的調(diào)控機制仍待進一步闡明。多蛋白橋梁因子MBF2最初在絲腺中被分離并證明作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)揮作用。劉慶信等人研究發(fā)現(xiàn)MBF2在絲腺中大量存在,且在絲腺并呈現(xiàn)周期性表達。我們推測MBF2在絲腺中發(fā)揮著重要功能�；诩倚Q基因組數(shù)據(jù)庫這一信息平臺,對MBF2進行了分析并對其在絲素重鏈基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用進行了研究,研究結(jié)果如下:1.家蠶MBF2家族基因的鑒定、表達分析及功能研究以MBF2氨基酸序列為質(zhì)詢序列,采用BLASTP程序檢索家蠶9倍基因組數(shù)據(jù)庫及NCBI庫,獲得了9個家族候選基因,并將其分別命名為MBF2-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9。信息分析結(jié)果顯示,它們均有EST數(shù)據(jù),且有些基因在染色體上成簇分布。氨基酸序列預(yù)測分析結(jié)果顯示該家族基因編碼的氨基酸殘基數(shù)目范圍為109-118個,且在N端均有信號肽,表明該家族基因在合成過程中需跨膜,很可能為分泌型蛋白。序列比對結(jié)果顯示,家蠶MBF2成員有較高的同源性,序列一致性高達41%。進化分析結(jié)果顯示,該家族基因為昆蟲特有的一類基因,家蠶MBF2-1、MBF2-2、MBF2-3及MBF2-7在進化樹中聚成一簇,并且它們與黑脈金斑蝶及樗蠶蛾的MBF2有著較近的進化關(guān)系。其他成員與參與免疫反應(yīng)的病原體響應(yīng)基因βREPAT聚成一簇,說明該基因家族很可能參與家蠶的免疫反應(yīng)。組織表達譜分析結(jié)果顯示該家族基因成員具有明顯的組織特異性,MBF2-1在絲腺及馬氏管中氋量表達,MBF2-5在中腸中氋量表達,MBF2-2、MBF2-3、MBF2-4、MBF2-6和MBF2-8在血液中氋量表達。而MBF2-7在脂肪體,精卵巢中較高的量的表達。時期表達譜分析結(jié)果則顯示,該家族基因表達呈現(xiàn)明顯的時期特異性,有些在預(yù)蛹期及蛹期氋量表達如MBF2-4、-6、-8和-9;而有些基因在蛹期的表達量較低但在幼蟲期氋量表達,如MBF2-2、MBF2-3、MBF2-5;而MBF2-1與上述基因均不同,在五齡期及預(yù)蛹期氋量表達;MBF2-7則各時期均有表達,但在眠期的表達量較低。幼蟲期是家蠶攝取食物獲得能量的時期,而蛹期則是完成成蟲組織器官的發(fā)生、形成、以及生殖細胞的發(fā)育、成熟的時期。絲腺、中腸、血液和脂肪體等組織均是是家蠶物質(zhì)和能量代謝的主要組織,表達譜分析顯示MBF2家族成員在這些組織及時期氋量表達,說明這些基因在家蠶代謝及發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。Bb攻毒實驗結(jié)果顯示,MBF2-4、MBF2-7、MBF2-9在注射Bb后1h被明顯的上調(diào)表達,然后在注射3h后下調(diào);MBF2-8則在注射12h后才被上調(diào)表達然后恢復(fù)到正常水平;與上述基因相反,MBF2-2和MBF2-3在注射Bb后3h被明顯的下調(diào)了,緊接著恢復(fù)到正常的表達水平。結(jié)果表明這些基因參與家蠶對Bb的免疫反應(yīng)。饑餓及恢復(fù)食桑實驗結(jié)果顯示,MBF2-1、-4及-8在饑餓的條件下被下調(diào)表達,而當恢復(fù)食桑后,基因開始上調(diào)表達;而MBF-2、-3、-6及-7則呈現(xiàn)出相反表達模式,MBF2-5及MBF2-9的表達模式上來看,它們的表達同樣被影響,但是與其他基因相比,變化的比較遲緩。以上結(jié)果表明該家族基因與營養(yǎng)代謝有著很緊密的關(guān)聯(lián)。2.MBF2的原核表達及表達模式分析通過構(gòu)建原核表達載體并誘導(dǎo)表達純化MBF2蛋白,并制備了多克隆抗體并用于后續(xù)實驗。絲腺不同區(qū)段q PCR結(jié)果顯示,MBF2僅在后部絲腺發(fā)生轉(zhuǎn)錄。絲腺不同區(qū)段Western blot結(jié)果顯示,不僅在后部絲腺檢測到了MBF2蛋白的存在,在前部絲腺及中部絲腺也檢測了MBF2蛋白的存在。蠶絲免疫熒光結(jié)果顯示,MBF2蛋白定位在絲膠層,且繭的最外層含量最高。以上結(jié)果表明該蛋白是一個分泌型蛋白,這與前面的預(yù)測是一致的。MBF2家族成員MBF2-8已經(jīng)被證明可以參與家蠶的免疫反應(yīng),說明繭中的MBF2很可能發(fā)揮抵御外來病原入侵的作用,這對以后研究MBF2在免疫方面的功能奠定了基礎(chǔ)。對MBF2在后部絲腺的表達時期進行Western blot及q PCR分析,結(jié)果顯示MBF2僅在后部絲腺發(fā)生轉(zhuǎn)錄,在四齡眠期氋量表達,在五齡前期也有較氋量的表達,而在五齡后期及上蔟其基本不表達。MBF2呈現(xiàn)出與fibH相反的表達模式,暗示MBF2可能參與絲素重鏈基因的轉(zhuǎn)錄。3.MBF2基因參與fibH的轉(zhuǎn)錄調(diào)控為了檢測MBF2是否參與fibH的調(diào)控,我們采用了雙螢光素酶報告系統(tǒng),首先,構(gòu)建了MBF2細胞過表達載體及fibH的螢火蟲螢光素酶報告載體,將它們轉(zhuǎn)入Bm E細胞,并進行了酶活測定。結(jié)果顯示,過表達MBF2可以影響fibH啟動子的活性。然而對MBF2的氨基酸序列分析,沒有預(yù)測到可以與DNA結(jié)合的功能域。那么MBF2很可能通過與其他的轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)控fibH的轉(zhuǎn)錄。通過亞細胞定位,我們發(fā)現(xiàn)MBF2與Bmdimm共定位于細胞核。為進一步確定它們之間的關(guān)系,通過利用體外原核表達重組蛋白進行Far-western實驗,結(jié)果顯示,MBF2在體外可以與Bmdimm相互作用。此外,在家蠶Bm E細胞系中進行Bi FC實驗,結(jié)果顯示,MBF2與Bmdimm可以相互作用。以上結(jié)果表明MBF2可以與Bmdimm相互作用。有意思的是,Bmdimm已經(jīng)證明參與絲素重鏈調(diào)控且對絲素重鏈起到正調(diào)控的作用,但是,當我們同時過表達MBF2和Bmdimm時,fibH啟動子的活性下調(diào)。結(jié)果表明MBF2可以抑制Bmdimm對fibH的調(diào)控作用并下調(diào)fibH啟動子的活性。4.FTZ-F1參與fibH轉(zhuǎn)錄調(diào)控已經(jīng)有文獻報道MBF2可以參與FTZ-F1對下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,但是兩者之間是否存在直接的相互作用關(guān)系尚未得知。我們首先原核表達,純化FTZ-F1蛋白并制備抗體。qPCR及Western blot分析結(jié)果顯示,FTZ-F1在五齡三天的各組織中均有表達。其中,五齡三天各組織Western blot結(jié)果顯示FTZF1在絲腺、馬氏管中的表達量較高。時期表達譜分析結(jié)果顯示,FTZ-F1在眠期的后部絲腺表達量最高,五齡期以后表達量逐漸降低,在五齡末期及上蔟期基本不表達,這種表達模式與MBF2表達模式一致,而與fibH表達模式相反。亞細胞定位、Co-IP、BiFC及Far-western等實驗結(jié)果顯示FTZ-F1與MBF2可以相互作用。我們已經(jīng)證明了MBF2可以參與fibH的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。那么FTZ-F1是否也參與fibH的轉(zhuǎn)錄調(diào)控呢?我們對fibH啟動子進行了分析,分析結(jié)果顯示,在fibH啟動子的-389~-397及-652~-659處存在FTZ-F1潛在的結(jié)合位點。EMSA及ChIP實驗結(jié)果顯示FTZ-F1可以與fibH(-389~-397)位點結(jié)合。當我們將啟動子該位點突變或是截短時,fibH啟動子的活性上調(diào)。為了對這一點進行進一步檢測,將該位點突變后的fibH啟動子螢光素酶報告載體與FTZ-F1過表達載體共轉(zhuǎn)進行酶活檢測,結(jié)果顯示,對fibH啟動子活性沒有顯著性變化。以上實驗結(jié)果顯示家蠶FTZ-F1通過結(jié)合該位點調(diào)控fibH啟動子活性。我們已經(jīng)證明單獨過表達MBF2或FTZ-F1均可以下調(diào)fibH的啟動子的活性,并且它們存在相互作用。為了研究兩者是否可以一起作用調(diào)控fibH,我們將MBF2及FTZ-F1同時過表達,結(jié)果顯示,fibH啟動子的活性下調(diào)更加顯著。結(jié)果說明MBF2與FTZ-F1相互作用并參與fibH的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。qPCR分析FTZ-F1及MBF2在大造及高絲量的品種872中后部絲腺的表達量,結(jié)果顯示MBF2及FTZ-F1在872中的表達量遠遠低于大造中的表達量。有趣的是,對fibH啟動子進行分析,發(fā)現(xiàn)fibH啟動子上FTZ-F1與Bmdimm的結(jié)合位點靠的很近,我們已經(jīng)證明它們均與MBF2相互作用。那么它們之間是否存在相互作用呢?我們對此進行了研究。BiFC及Far-western實驗結(jié)果顯示,FTZ-F1可以與Bmdimm相互作用。雙螢光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示,單獨過表達Bmdimm時,fibH啟動子活性上調(diào)。當將FTZ-F1與Bmdimm共表達時,fibH啟動子的活性無明顯變化。結(jié)果表明Bm FTZ-F1可以抑制Bmdimm對fibH啟動子活性的上調(diào)作用。5.蛻皮激素對fibH調(diào)控的影響到目前為止,關(guān)于蛻皮激素調(diào)控家蠶fibH的報道比較少。為了研究蛻皮激素對家蠶fibH轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響,我們將fibH啟動子的螢光素酶報告載體轉(zhuǎn)入細胞,然后用蛻皮激素處理細胞,酶活檢測結(jié)果顯示,20E可以調(diào)控fibH啟動子活性,并呈現(xiàn)出劑量依賴性的影響。那么20E是怎么實現(xiàn)對fibH調(diào)控的呢?已經(jīng)有文章報道,無論在體內(nèi)還是在體外,當用20E處理后部絲腺時均可以誘導(dǎo)FTZ-F1的表達。MBF2與FTZ-F1在后部絲腺中有著相似的表達模式。那么MBF2是否受蛻皮激素調(diào)控呢?我們對MBF2啟動子進行了預(yù)測分析,分析結(jié)果顯示,在MBF2啟動子上游有BrC、EcR、E74A等多個核激素受體的作用元件。蛻皮激素的誘導(dǎo)實驗結(jié)果顯示,無論是在體內(nèi)還是體外,MBF2均被20E上調(diào)表達,我們還發(fā)現(xiàn)當MBF2被上調(diào)表達時,fibH的表達量卻下調(diào)了。該結(jié)果說明20E很可能通過調(diào)控MBF2參與fibH的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。我們已經(jīng)證明MBF2可以與FTZ-F1相互作用并參與fibH的調(diào)控。有文獻報道20E可以誘導(dǎo)后部絲腺內(nèi)FTZ-F1的表達。綜合以上結(jié)果表明蛻皮激素可以通過MBF2及FTZ-F1介導(dǎo)調(diào)控fibH的轉(zhuǎn)錄。綜合上述結(jié)果,20E誘導(dǎo)FTZ-F1及MBF2表達,而這兩個蛋白可以與Bmdimm相互作用并抑制其對fibH的調(diào)控,從而實現(xiàn)fibH低量表達或是不表達。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;S881.2

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1 周春燕;MBF2家族鑒定及其成員MBF2-1參與絲素重鏈轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究[D];西南大學(xué);2016年

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本文編號：1298849