本文關(guān)鍵詞：大豆低豐度蛋白的分離、鑒定及其提取物對(duì)小鼠的生理效應(yīng)研究

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【摘要】：在大豆中表達(dá)量較少的大豆低豐度蛋白,因受傳統(tǒng)提取方法的限制及檢測時(shí)高豐度蛋白的遮蔽作用,使其提取及鑒定成為大豆蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一大挑戰(zhàn)。因此,本研究對(duì)大豆低豐度蛋白的提取方法進(jìn)了優(yōu)化,并試圖在鑒定提取物成分的基礎(chǔ)上揭示大豆低豐度蛋白提取物對(duì)斷奶小鼠的生理功能效應(yīng)(無大豆高豐度蛋白干擾)。1大豆低豐度蛋白的分離、鑒定本研究探究了異丙醇濃度、超聲功率、超聲時(shí)間和總提取時(shí)間等因素對(duì)大豆低豐度蛋白分離的影響,優(yōu)化了其提取條件,并對(duì)最佳條件下的提取物成分通過SDS-PAGE、MS及液相、氣相色譜等方法進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示：(1)50%異丙醇去除大豆高豐度蛋白的效果較好,超聲功率400 W、超聲10 min和提取1h(超聲時(shí)間+水浴震蕩)分別是大豆低豐度蛋白的最佳提取單因素條件,且超聲處理的作用遠(yuǎn)大于總提取時(shí)間的。(2)大豆低豐度蛋白提取、富集的最佳條件為：50%異丙醇,超聲功率350 W,超聲15 min,提取1 h。(3)大豆低豐度蛋白提取物中檢測到一些無法通過常規(guī)提取法獲得的低豐度蛋白如磷酸酯-D、β-淀粉酶、16.5 KD油質(zhì)蛋白、無特征大豆蛋白和未知大豆蛋白,且無高豐度蛋白(大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白)和大豆異黃酮,而異丙醇和丙酮的殘留量分別僅為0.0231%和0.0430%。2大豆低豐度蛋白提取物(以下簡稱提取物)對(duì)小鼠生長性能的影響選用180只21日齡ICR斷奶小鼠,分成5組(對(duì)照和Do.5mg, D1mg,D2mg,D4mg等4個(gè)處理組,mg代表灌胃液中的低豐度蛋白量),每組3個(gè)重復(fù)。飼喂AIN93G標(biāo)準(zhǔn)化小鼠純合日糧1周以適應(yīng)環(huán)境,28日齡開始灌胃試驗(yàn),探究不同劑量提取物對(duì)小鼠生長性能的影響。結(jié)果顯示：(1)各試驗(yàn)期處理組小鼠的體重均高于其對(duì)照,且D2mg組最高。(2)除1-7 d外,其他試驗(yàn)期處理組小鼠的日增重、肉料比和增長率均高于其對(duì)照,且D2mg組最高。(3)7 d時(shí),E組小鼠心臟指數(shù)顯著低于對(duì)照妒0.05)；28 d時(shí),處理組小鼠心臟、腎臟指數(shù)均高于對(duì)照。綜上所述,大豆低豐度蛋白提取物在1-7 d時(shí)對(duì)小鼠生長有一定抑制作用；隨著試驗(yàn)期的延長,提取物表現(xiàn)出明顯的促生長效果,且以D2mg組的效果最佳。3提取物對(duì)小鼠免疫功能和抗氧化能力的影響本試驗(yàn)旨在研究提取物對(duì)小鼠免疫功能和抗氧化能力的影響,試驗(yàn)動(dòng)物及分組等同上。結(jié)果顯示：(1)7、14、21 d時(shí)的D2mg、D4mg組小鼠血清白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)目均高于對(duì)照,且E組最高。(2)7、28 d時(shí),各試驗(yàn)組小鼠胸腺指數(shù)均無顯著差異,但各試驗(yàn)期D2mg組均低于對(duì)照；7、14、21 d時(shí)的處理組小鼠脾臟指數(shù)與其對(duì)照差異不顯著,其中各試驗(yàn)期D4mg組均高于對(duì)照；7、14、21 d時(shí)處理組的肝臟指數(shù)低于對(duì)照,28 d時(shí)均高于對(duì)照。(3)各試驗(yàn)期D2mg組小鼠血清IL-2含量高于對(duì)照；7、28 d時(shí)各試驗(yàn)處理組的IL-10、IgG和TNF-α含量與對(duì)照相比無顯著差異,且28 d時(shí)的D2mg組IL-2、 IgG口]NF-α含量高于其他組；7、28 d(D2mg組除外)時(shí),各試驗(yàn)處理組小鼠脾臟的IL-2、 TNF-α基因相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照；28 d時(shí)各試驗(yàn)組間的His、D-乳酸含量無顯著差異,但D2mg組均低于對(duì)照,而7 d時(shí)高于其對(duì)照。(4)28 d時(shí)各試驗(yàn)處理組小鼠血清的T-AOC含量均高于對(duì)照,各試驗(yàn)期Dlmg、D2mg組小鼠血清T-AOC含量高于對(duì)照；7 d時(shí)各試驗(yàn)組小鼠肝臟的SOD、CAT和GPX基因相對(duì)表達(dá)量差異不顯著,28 d時(shí)的Dlmg、D2mg組高于對(duì)照。以上結(jié)果表明：7 d時(shí),灌胃提取物使小鼠的機(jī)體發(fā)生了免疫反應(yīng),導(dǎo)致其腸道一定程度受損,但對(duì)小鼠抗氧化能力無顯著影響。4提取物對(duì)小鼠消化代謝相關(guān)血液指標(biāo)和基因表達(dá)的影響本試驗(yàn)探究了提取物對(duì)小鼠消化代謝的影響,試驗(yàn)動(dòng)物及分組等同上。結(jié)果顯示：(1)28 d時(shí)各試驗(yàn)組小鼠血清的TC和TG含量無顯著差異,且D 2mg組最低；7、14 d各試驗(yàn)處理組小鼠血清的Apo-B含量均高于其對(duì)照,21、28 d各試驗(yàn)處理組均低于其對(duì)照(28 d時(shí)D0 5mg組除外)；7 d時(shí)D2mg組小鼠肝臟HMG-CoA、ACS、SREBP-1c和SREBP-2基因相對(duì)表達(dá)量均低于其他各處理組,28 d時(shí)D21ng組小鼠肝臟HMG-CoA、ACS在所有試驗(yàn)組中最高,而D4mg組SREBP-1c和SREBP-2最高。(2)7、14、21d各試驗(yàn)組血清GLU含量無顯著差異,28 d時(shí)各試驗(yàn)處理組均高于對(duì)照；各試驗(yàn)期D1mg、D2mg組小鼠血清胰島素水平較高,D4mg組低于對(duì)照；7 d時(shí)D0.5mg、D1mg組小鼠肝臟PEPCK、GCK基因相對(duì)表達(dá)量較高,而D2mg、D4mg組較低；28 d時(shí)在所有試驗(yàn)組中,D4mg組PEPCK最低但GCK最高。(3)28 d時(shí)的處理組小鼠血清ALB、GLB含量和A/G與對(duì)照無顯著差異,7 d時(shí)的處理組小鼠血清ALB含量與對(duì)照無顯著差異,GLB含量高于對(duì)照而A/G低于對(duì)照；7 d時(shí)的處理組小鼠肝臟ALB基因相對(duì)表達(dá)量均高于其對(duì)照,28 d時(shí)的D4mg組低于其他各試驗(yàn)組。7d時(shí)的處理組小鼠血清ALT含量均低于其對(duì)照,21、28 d(D0.5mg組ALT除外)均高于其對(duì)照�？傊�,提取物通過對(duì)小鼠血清胰島素水平、肝臟代謝基因HMG-CoA.ALB和PEPCK表達(dá)量等影響改變了小鼠機(jī)體糖、脂、蛋白質(zhì)的消化代謝,且尤以D2mg組最為明顯。5提取物對(duì)小鼠小腸微生物菌群的影響本試驗(yàn)通過高通量測序法研究了不同劑量灌胃提取物小鼠的小腸細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性和組間相似性。結(jié)果表明：(1)適量(D0.5mg、D1mg、D2mg組)提取物改變了小鼠腸道的微生物區(qū)系,提高了小鼠小腸內(nèi)的微生物豐富度,增加了微生物的多樣性。(2)在門的水平上,厚壁菌門(83.15% -91.96%)、藍(lán)菌門、放線菌門、變形菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌門；在屬的水平上,鏈球菌屬、芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、乳酸球菌屬、Allobaculum、Chloroplast等為優(yōu)勢菌屬。(3)試驗(yàn)D2mg組乳酸菌(乳酸桿菌和乳酸球菌之和)屬所占比例最高,比對(duì)照提高25.11%,其中乳酸桿菌屬所占比例顯著高于D0.5mg、D4mg(P0.05)。(4)各試驗(yàn)組共享1620個(gè)OTU,占細(xì)菌總OTU數(shù)目的10.53%；Unifrac主坐標(biāo)分析結(jié)集也表明不同試驗(yàn)組小腸微生物群落結(jié)構(gòu)存在一定差異,且同組個(gè)體之間也具有較大差異。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S816

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本文編號(hào)：1291632