本文關鍵詞：家蠶染色體構象及其對絲素蛋白表達調控的研究

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【摘要】：昆蟲泌絲是我們生活中非常常見的現(xiàn)象,如蜘蛛結網(wǎng),昆蟲結繭,蜜蜂筑巢等泌絲行為都具有獨特的生物學意義。但在眾多的泌絲昆蟲中,家蠶經(jīng)進化獲得了強大產(chǎn)絲能力,加上4000多年的人工馴化,使家蠶成為迄今為止吐絲能力最強的昆蟲之一。家蠶一生食下20g桑葉,其絲腺可分泌0.5g繭絲。絲蛋白主要由三種絲素蛋白和三種絲膠蛋白組成,其中含量最高的絲素重鏈蛋白Fib-H占總繭絲量的70%,所以一頭蠶可以合成并分泌0.35g的絲素重鏈蛋白。轉錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),Fib-H基因m RNA占總m RNA的19.3-54.5%。一個基因的表達量如此之高在自然界中也是非常罕見的。研究發(fā)現(xiàn)調控Fib-H基因表達的兩種可能的機制:后部絲腺細胞核內復制形成超級多倍體細胞;多種轉錄因子協(xié)同調控其精細的時空特異性表達。但兩種因素并不能完全解釋絲蛋白的高量表達,是否存在其他調控方式呢?早期日本學者發(fā)現(xiàn)Fib-H基因表達和不表達時其基因區(qū)域染色體狀態(tài)不同。隨著基因組研究技術的發(fā)展和對染色體結構認識水平的提高,染色體狀態(tài)不同是由染色體的空間結構變化導致的并參與了基因的表達調控。研究染色體的空間結構的主要方法是染色體構象捕獲技術及其衍生技術。那么染色體的構象是否參與Fib-H基因表達調控的問題依然不清楚。本文利用染色體構象捕獲技術獲取家蠶全基因組染色體互作圖譜,并從染色體互作圖譜中分析Fib-H基因區(qū)域染色體構象,推測基因組三維空間結構對Fib-H基因表達調控的影響,并通過CRISPR/Cas9特異性編輯后部絲腺的核纖層蛋白基因破壞染色體構象來研究染色體結構變化對Fib-H蛋白表達的影響。取得的主要研究結果如下:1.獲得家蠶Bm E細胞系及不同時期絲腺組織的全基因組染色體互作圖譜與三維基因組模型利用基于高通量測序的染色體構象捕獲技術(Hi C)構建文庫,經(jīng)測序、分析得到了Bm E細胞系(Bm E)、4齡眠期后部絲腺(4M-PSG)、5齡3天中部絲腺中部(5L3-MMSG)、5齡3天中部絲腺后部(5L3-PMSG)、5齡3天后部絲腺(5L3-PSG)及預蛹1天后部絲腺(PP1-PSG)的全基因組染色體互作圖譜,結果顯示,細胞系和組織(絲腺)均表現(xiàn)為染色體內的相互作用頻率高,染色體間的相互作用頻率低,說明家蠶細胞的染色體傾向于分布在細胞核內相對獨立的區(qū)域形成染色體疆域。染色體間的相互作用以反式互作圖譜形式展示。在Bm E細胞系的反式互作圖譜中,Chr5、Chr13、Chr22間互作頻率高,由于染色體間的互作圖譜中染色體之間的互作頻率間接反映染色體在細胞內的空間分布,所以推測3條染色體在Bm E細胞群體細胞核中位于空間上相對較近的位置。5L3-PSG的Chr11與Chr14間的互作頻率高,4M-PSG無互作頻率較高的的染色體,5L3-MMSG和5L3-PMSG組織中的Chr8與Chr24有較高互作頻率,PP1-PSG的Chr7與Chr22,Ch4與Chr7間的互作頻率高,推測這些互作頻率高的染色體在空間上更加靠近。根據(jù)染色體構象捕獲數(shù)據(jù)模擬出細胞內基因組三維結構,主要有兩種形式:Bm E細胞系相對同質化,染色體間互作頻率較高;絲腺組織相對異質化,染色體內互作頻率較高。2.家蠶染色體互作圖譜中的區(qū)室化(Compartment)與拓撲相關區(qū)域(Topologically associated domain,TAD)分析分析顯示染色體內的互作是家蠶細胞內最主要互作模式。染色體內各位點之間的相互作用稱為順式相互作用,順式互作圖譜的主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)是染色體區(qū)室(compartment)劃分的依據(jù),以染色體互作圖譜的形式展示。家蠶Bm E細胞及組織樣本的染色體互作圖譜顯示,家蠶基因組相互作用存在相對更小的染色體互作區(qū)域——染色體區(qū)室,而染色體區(qū)室具有細胞類型特異性并且與染色質的開放與封閉有關。家蠶Bm E細胞染色體區(qū)室較明顯,一般將染色體分為1-6個區(qū)室。組織樣品的染色體區(qū)室化更加復雜,主成分分析中第一特征向量并不能很好反映染色體區(qū)室,需要結合第二特征向量進行分析,且各染色體之間的差異非常大。有些染色體只有一個染色體區(qū)室,說明整條染色體均分布于這個區(qū)室,染色體狀態(tài)較為相近。而有些染色體可分成多個區(qū)室,說明染色體的不同區(qū)段位不同的區(qū)室,染色體的狀態(tài)隨著區(qū)室的變化而變化。絲腺組織樣品間的染色體區(qū)室差別較大,由于不同時期及不同部位的絲腺細胞在功能上存在差異,所以染色體特異的區(qū)室為細胞在特定時空下實現(xiàn)其功能提供了必要的環(huán)境。如果兩種組織功能差異非常大,其染色體區(qū)室也會相應的發(fā)生變化。染色體內更小層級的功能性互作模式為TAD,TAD位點間相互作用頻率非常高,但TAD外的區(qū)域即使在線性距離上靠近,相互作用頻率也非常低。家蠶細胞與組織的TAD分析顯示,Bm E細胞系的TAD大小為100kb~1Mb,而組織樣品中既含有較小的TAD,也包含較大的TAD,分布范圍為0.1Mb~2Mb。這與TAD的功能性有關,TAD為相互作用的基因提供微環(huán)境保證基因表達調控更加的精準,多在基因的增強子-啟動子區(qū)域調控基因表達。較小的TAD負責執(zhí)行基因本底表達,相對保守,而大的TAD實現(xiàn)基因的調控表達,具有組織時期特異性。3.5齡3天后部絲腺中三條染色體具有特殊的互作模式根據(jù)全基因組染色體互作圖譜分析發(fā)現(xiàn)5L3-PSG的Chr11、Chr24和Chr25三條染色體內的相互作用具有特殊的染色體互作模式,即一段區(qū)域將染色體分成兩個相對獨立的互作頻率很高的染色體區(qū)域,而兩個區(qū)域之間的互作頻率很低。將Chr11分成兩部分的區(qū)域為Chr11:4,100,000~4,300,000,此區(qū)域內并未注釋到編碼基因;將Chr24分成兩部分的區(qū)域為Chr24:14,600,000~15,000,000,家蠶基因組精細圖譜中為gap區(qū);Chr25的間隔區(qū)域為Chr25:11,700,000~11,900,000,此區(qū)域內只有Fib-H基因。分析發(fā)現(xiàn)編碼三個絲膠蛋白的基因均位于Chr11,Sericin1位于較小的染色體互作區(qū)域,而Sericin2、sericin3位于較大的另一區(qū)域。Chr24不含有絲蛋白基因所以并未深入分析。絲膠蛋白基因與絲素蛋白基因在家蠶中超高量表達形成繭殼,兩類蛋白占繭殼總量的75%。染色體內特殊的互作模式是否參與調控絲蛋白基因的高量表達,目前仍不清楚。為了鑒定染色體的結構與絲蛋白高量表達之間的關系,本研究分析了不同時期與部位的絲腺組織材料(4M-PSG、5L3-MMSG、5L3-PMSG、PP1-PSG)的染色體相互作用,結果顯示所有樣品中Chr11均出現(xiàn)特殊的染色體結構,而Chr25號染色體僅在5L3-PSG樣品中表現(xiàn)出特殊的染色體互作模式。5L3-MMSG與5L3-PMSG其它染色體間相互作用基本一致,4M-PSG與5L3-PSG中其它染色體間相互作用相近。雖然PP1-PSG為后部絲腺材料,因絲蛋白表達已經(jīng)結束并進入預蛹期準備化蛹,其染色體結構與其它4個樣品差異較大,說明染色體的結構與功能的一致性。5個組織樣品中Chr25的差異較大,且分隔區(qū)域為Fib-H基因,兩者之間主要表現(xiàn)在Fib-H基因的表達活性上。Fib-H基因在5L3-PSG中具有表達活性,在4M-PSG中暫時無表達活性,在PP1-PSG中失去表達活性,在5L3-MMSG、5L3-PMSG中永久性無表達活性。Chr25特殊互作模式的出現(xiàn)與Fib-H基因高量表達均具有組織時期特異性。此結果與1993年Waga等檢測4眠與5齡期后部絲腺以及5齡中部絲腺時發(fā)現(xiàn)Fib-H基因區(qū)域的5’上游、增強子-啟動子區(qū)域和主要的蛋白編碼區(qū)域的DNase I敏感性具有明顯差異,即染色體結構差異的結果一致[1]。推測Chr25染色體相互作用模式的差異暗示著這可能參與Fib-H基因的表達調控。相比Chr25的差異,Chr11在所有樣品中均表現(xiàn)出特殊的染色體互作模式。分析發(fā)現(xiàn)5個樣品存在細微的差異,僅在5L3-MMSG、5L3-PMSG中三個絲膠蛋白基因位點之間存在明顯的相互作用。所以推測Chr11的特殊染色體互作模式不具有組織時期特異性,但絲膠蛋白基因之間的染色體互作具有組織特異性。4.利用CRISPR/Cas9技術初步探索3D基因組結構對絲腺中基因表達的影響Chr25在5齡3天后部絲腺中的特殊染色體構象是否對Fib-H基因表達起調控作用仍不清楚。因此本研究通過基因編輯改變維持染色體構象的方法,研究其對Fib-H基因表達的影響。核纖層蛋白在細胞核形態(tài)維持與核內染色體分布的過程中起著重要作用,核纖層蛋白的缺失會導致細胞核內染色體分布的紊亂從而改變細胞核內基因組三維空間上的互作。核纖層蛋白在多個物種中高度保守,參考家蠶全長c DNA文庫中鑒定的lamin C-like的序列[2],經(jīng)TA克隆測序驗證開放閱讀框(ORF),它與文庫中的序列一致,將lamin C-like基因命名為Bmlamin A/C。鑒定的Bmlamin A/C基因全長為15111bp,包含10個外顯子與9個內含子,m RNA全長3262bp,ORF編碼620個氨基酸,含有兩個保守結構域。定量PCR檢測Bmlamin A/C基因的組織達譜,結果顯示Bmlamin A/C基因在5齡3天的頭部、脂肪體、馬氏管、中腸、絲腺及生殖腺組織中均有表達。近年來本實驗室先后采用ZFN、TALEN與CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)實現(xiàn)了家蠶基因編輯,三種方法均通過胚胎注射瞬時表達的人工核酸酶的m RNA或質粒,篩選可遺傳的突變后代獲取轉基因個體。瞬時編輯方法對胚胎致死基因或發(fā)育調控基因的編輯存在較大限制。而Bmlamin A/C基因編碼重要的結構蛋白,全身敲除會嚴重影響家蠶生長發(fā)育,無法研究染色體結構變化對絲蛋白合成的影響,所以需要構建組織特異性基因編輯系統(tǒng)。本研究首先構建了高效靶位點篩選系統(tǒng),利用此系統(tǒng)確定靶位點的突變效率,篩選用于個體基因編輯的高效率位點。隨后分別構建在后部絲腺特異性表達Cas9的轉基因家蠶,全身性表達靶向g RNA的轉基因品系,雜交后篩選轉基因標記,得到組織特異的靶基因編輯突變個體。根據(jù)上述策略得到了后部絲腺特異性表達Cas9轉基因品系以及全身性表達靶向編輯Bmlamin A/C基因的g RNA轉基因品系,雜交后共獲得2個后部絲腺特異靶向編輯Bmlamin A/C基因的轉基因系。檢測顯示基因組水平上Bmlamin A/C基因靶位點100%突變,m RNA下調43.7%-74.3%,蛋白表達量下降了83%-91%。2個轉基因品系中Bm Lamin A/C蛋白的表達量下調,絲蛋白合成能力均受到影響,繭層率顯著下降,其中一個品種有部分幼蟲甚至不能吐絲結繭。轉基因個體中后部絲腺細胞數(shù)無明顯變化,但絲腺細胞排列紊亂,絲腺變短,絲腺腔變大中空,表型與Fib-H基因敲除(本實驗室前期研究)的轉基因個體相似。熒光定量PCR結果顯示后部絲腺中主要絲素蛋白基因表達量下調。轉錄組數(shù)據(jù)分析顯示,Fib-H基因表達量從總TPM值的20%下降到10%,表明突變體中基因組結構的變化對Fib-H基因的影響最大。根據(jù)以上結果推斷染色體的三維結構調控Fib H基因的表達。綜合以上研究結果,本研究利用Hi C染色體構象捕獲方法獲得家蠶細胞及組織的全基因組染色體互作圖譜,并對染色體構象參與絲蛋白表達調控進行了初步的分析。結果顯示,Chr25特殊的染色體互作模式的出現(xiàn)與Fib-H基因的表達均具有組織時期特異性,暗示前者對后者存在調控作用;利用基因編輯技術實現(xiàn)后部絲腺染色體結構的擾亂,絲蛋白的表達量明顯下調,表明染色體的構象可能是一種新的調控絲蛋白高量表達的因素。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S881.2

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