本文關(guān)鍵詞：殺蟲劑多殺菌素引起昆蟲細(xì)胞死亡的分子機(jī)制研究

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【摘要】：多殺菌素是由刺糖多孢菌發(fā)酵產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)脂類殺蟲抗生素。因其具有殺蟲效率高,無交互抗性,對(duì)非靶標(biāo)生物毒性低和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),多殺菌素已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物害蟲綜合治理,以及倉儲(chǔ)害蟲防控和畜類寄生蟲防治。自噬,基因控制下的自主性有序細(xì)胞死亡,是細(xì)胞對(duì)其內(nèi)部衰老或受損的細(xì)胞器,錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)以及侵入的病原體進(jìn)行降解的生物學(xué)過程,在多細(xì)胞生物生長發(fā)育,結(jié)構(gòu)重建,維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等過程中起重要作用。多殺菌素誘導(dǎo)自噬的研究尚未見報(bào)道,其潛在的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。為此,本研究將Sf9細(xì)胞暴露于多殺菌素,重點(diǎn)研究了線粒體損傷及自噬效應(yīng)的誘導(dǎo),并對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行了探究。本文研究證實(shí),多殺菌素對(duì)Sf9細(xì)胞的增殖抑制作用呈劑量依賴效應(yīng),當(dāng)濃度達(dá)到40μmol/L時(shí)該抑制作用到達(dá)極顯著水平(p0.01)。60μmol/L多殺菌素可誘導(dǎo)Sf9細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞質(zhì)空泡化和細(xì)胞核固縮等形態(tài)變化,并伴隨著ROS累積以及線粒體功能紊亂,如線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放、線粒體膜電位崩潰等。同時(shí),多殺菌素可以誘導(dǎo)Sf9細(xì)胞Bcl-2/Bax比率顯著降低,引起mPTP依賴性和非依賴性細(xì)胞色素C釋放,觸發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。50μmol/L的CsA預(yù)孵Sf9細(xì)胞18h,可部分抑制由多殺菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞色素C的釋放,并有利于減弱細(xì)胞質(zhì)空泡化。本文另一研究重點(diǎn)是探明多殺菌素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的分子機(jī)制,MDC熒光染色和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察證實(shí)60μmol/L多殺菌素誘導(dǎo)Sf 9細(xì)胞中自噬體形成。為進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)論,本文用60μmol/L多殺菌素作用于Sf 9細(xì)胞,分別檢測(cè)到自噬相關(guān)蛋白Beclin 1表達(dá)增加、LC3-B蛋白轉(zhuǎn)化率上升和p62蛋白被降解。自噬抑制劑3-MA預(yù)孵Sf 9細(xì)胞,結(jié)果表明自噬被抑制后由多殺菌素誘導(dǎo)的Sf9細(xì)胞自噬體形成被減弱,Sf9細(xì)胞的增殖抑制被逆轉(zhuǎn)了 36.7%,證實(shí)自噬發(fā)生導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)自噬體的累積,并介導(dǎo)了細(xì)胞的死亡。為了探究溶酶體在多殺菌素誘導(dǎo)的Sf9細(xì)胞自噬過程中的作用,熒光雙標(biāo)法觀察到線粒體和溶酶體的共定位,并檢測(cè)線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1和Parkin蛋白表達(dá),證實(shí)線粒體自噬的發(fā)生。60μmol/L多殺菌素作用于Sf 9細(xì)胞,誘導(dǎo)溶酶體膜蛋白Lamp 2表達(dá)增加,且溶酶體組織蛋白酶CathepsinB和CathepsinLmRNA表達(dá)同步增加證實(shí)溶酶體參與損傷線粒體清除過程。多殺菌素處理引起Sf 9細(xì)胞ATP含量降低,并誘導(dǎo)AMPK和TSC2蛋白的磷酸化增強(qiáng)以及mTOR和p70S6K蛋白的磷酸化減弱,表明多殺菌素誘導(dǎo)的Sf細(xì)胞線粒體自噬伴隨著AMPK/mTOR信號(hào)通路的激活。此外,研究了多殺菌素誘導(dǎo)的Sf9細(xì)胞氧化應(yīng)激和DNA損傷。結(jié)果顯示,60μmol/L多殺菌素作用于Sf9細(xì)胞,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)MDA含量增加,SOD、CAT活性顯著降低,但GST活性上升不明顯,證實(shí)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激。多殺菌素導(dǎo)致細(xì)胞核8-oxoG的生成增加,并進(jìn)一步誘導(dǎo)DNA修復(fù)酶OGG1和MTH1的表達(dá)上升,證實(shí)DNA的氧化損傷。中性彗星電泳和微核化分析,判定多殺菌素處理的細(xì)胞中出現(xiàn)DNA雙鏈斷裂和染色體畸形等嚴(yán)重氧化損傷。
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S482.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 侯文杰;李飛;吳青君;徐寶云;張友軍;;西花薊馬對(duì)多殺菌素的抗性生化機(jī)制研究[J];應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào);2013年04期

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本文編號(hào)：1266067