本文關鍵詞：小麥抗條銹病基因Yr41的精細定位和兩個條銹菌誘導表達基因的功能研究

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【摘要】：小麥條銹病是由條銹菌(Puccinia striiformis West.f.sp.tritici)引起的葉部真菌病害,是世界性的小麥病害,在中國尤為嚴重,嚴重危害小麥產量與品質。培育抗病小麥品種是防治條銹病的有效方法,但隨著條銹菌新生理小種的不斷出現,特別是V26新小種的出現,致使大部分抗病小麥品種喪失抗性。通過對抗病基因緊密連鎖的分子標記開發(fā)和精細定位,為抗病基因的克隆、分子標記輔助育種和多基因聚合的持久抗性品種培育奠定基礎,對小麥抗條銹病遺傳育種研究具有理論和實踐價值。小麥抗病防御反應是多基因參與的調控過程,通過對抗條銹病調控基因的克隆與表達特性分析,探討這些基因在抗條銹病防御反應中的作用機理,為闡明寄主與條銹菌間互作的分子機理提供科學依據。本研究以抗條銹病基因Yr41載帶的小麥抗病品種川農19(CN19)為研究材料,通過構建的CN19/MY11遺傳連鎖作圖群體及其高代重組自交系,進行了條銹菌CRY32接種下的作圖群體單株抗病性鑒定和遺傳分析；采用比較基因組分析和BSA-RNA-Seq測序方法,進行了EST-STS和SNP引物的開發(fā)和標記篩選,繪制Yr41基因的精細連鎖遺傳圖；利用實時熒光定量PCR(Q-RT-PCR)與病毒誘導基因沉默(VIGS)的技術,對已克隆的條銹菌誘導表達基因TaLHY和TaNIT,進行了基因表達特性與功能研究,主要研究結果如下：1.配制了小麥品種CN19/MY11雜交F_1、F_2、F_(2：3)代研究群體,進行了抗條銹病遺傳分析,進一步明確了小麥品種CN19中含有的Yr41基因是一個顯性的成株期抗條銹病基因；構建了含3212個單株的CN19/MY11雜交F_2代遺傳作圖群體及其高代重組自交系,通過小麥2BS上公布的EST序列,設計了127個EST-STS分子標記引物,利用F_(2：3)分離群體分組法(BSA)對該EST-STS引物進行篩選,共獲得了8對與Yr41基因基因緊密連鎖的分子標記,通過Kosambi函數計算與目的基因的連鎖關系：BE444541-BE474133-BE604911-Yr41-BE446068-BE444659-BF478477-BI479116-BE496167,分子標記間相對遺傳距離分別為0.83、0.19、0.06、0.19、0.06、0.44、0.19與0.32cM,使Yr41基因兩邊連鎖標記距離由8.9cM縮短至0.25cM,最小標記達到0.06 cM,將Yr41基因進一步定位在小麥2BS3-0.84-1.00區(qū)段內。2.通過Blast本地化程序將緊密連鎖的8條EST序列與小麥基因組草圖以及短柄草、水稻和玉米基因組進行同源關系分析,根據同源基因位點,共設計201個分子標記,但篩選結果顯示這些分子標記與Yr41沒有連鎖關系。通過生物信息學方法對這8條EST序列對應的基因注釋結果顯示,近共分離的EST序列BE604911注釋信息為THO復合體,該蛋白在擬南芥中證實為植物抗病防御的關鍵蛋白,可作為Yr41的候選基因進一步研究。3.通過對重組自交系(RIL)F_6代中抗病和感病兩個表現型50(純抗)+50(純感)樣本組進行BSA-RNA-Seq轉錄組高通量測序,共得到57.14Gb Clean Data。利用生物信息方法對這些數據進行分析,共計注釋約1.5萬個小麥新基因,在抗病和感病兩個表現型樣本組中篩選到5919個差異表達基因。對BSA群體進行SNP位點的關聯定位分析,在2BS染色體上尋找到52個SNP位點,其中有38個SNP位點設計出四引物擴增受阻突變體系引物。通過對作圖群體單株DNA的PCR產物檢測,共計發(fā)現4個SNP位點與Yr41緊密連鎖,他們與目的基因的連鎖關系為3523042/2963-3523042/3033-5186704/3797-Yr41-5245446/8902,其中3523042/2963、3523042/3033與5186704/3797分子標記與目的基因的遺傳距離為0.06 cM,5245446/8902分子標記的遺傳距離為0.25cM,增加了Yr41所在區(qū)段的密度。4.對TaLHY基因的表達和功能研究結果初步證明了該基因調控和參與小麥的穗生長與抗條銹病的防御反應過程；發(fā)現TaLHY是小麥晝夜節(jié)律基因,具有白天上調表達,夜晚下調表達量特性。利用實時熒光定量PCR的結果顯示,TaLHY基因主要在小麥葉、穗與莖組織中表達,根部表達較少；外源激素SA能極顯著的誘導該基因上調表達。在拔節(jié)期對抗病小麥CN19進行VIGS基因沉默,發(fā)現TaLHY沉默植株無法抽穗,對條銹菌生理小種條中32親和互作表現感病(IT=4)。5.利用VIGS方法對克隆的TaNIT(晴水解酶)進行基因沉默研究,發(fā)現抗病植株沉默和未沉默植株的生長和對條銹菌應答反應無明顯變化。
【學位授予單位】：四川農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S435.121.42

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