發(fā)布時間：2017-12-07 03:06

  本文關(guān)鍵詞：西瓜根系滲透脅迫下轉(zhuǎn)錄組與microRNA分析及相關(guān)基因功能研究

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【摘要】：干旱是影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要環(huán)境因子之一。我國干旱和半干旱區(qū)域約占國土面積的50%。而在濕潤的地區(qū)也會遭受到季節(jié)性和周期性的干旱。在解決干旱問題的方法中,培育抗旱耐旱新品種是重要的手段之一。而抗旱耐旱新品種的培育就要求我們了解作物對干旱脅迫的響應(yīng)和調(diào)控機制。根系在植物吸收水分、營養(yǎng)物質(zhì)及感受水脅迫信號中發(fā)揮重要作用,同時也是受干旱影響最大的器官,故了解根系對干旱脅迫的響應(yīng)和應(yīng)對具有重要意義。西瓜[Citrullus lanatus(Thumb.)Matsum.Nakai.]是一種重要的水果型經(jīng)濟(jì)園藝作物,其栽培面積占世界蔬菜栽培面積的7%。西瓜整個生長期需要大量水分,季節(jié)性干旱及頻繁發(fā)生的自然干旱嚴(yán)重影響了西瓜的產(chǎn)量、品質(zhì),甚至整個西瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。M08是一個經(jīng)鑒定較為抗旱的西瓜自交系。本研究以M08根系為材料,用20%PEG模擬干旱脅迫,采用Illumina Hiseq 2500平臺對脅迫后的根系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組、miRNA及降解組測序和分析,其結(jié)果為了解西瓜根系響應(yīng)、應(yīng)對滲透脅迫機制和西瓜抗旱耐旱遺傳改良提供了基礎(chǔ)信息。同時對脯氨酸合成相關(guān)酶的活性及編碼基因表達(dá)模式進(jìn)行了研究,明確了脯氨酸的長距離運輸方式,并將脯氨酸合成限速酶P5CS編碼基因轉(zhuǎn)擬南芥進(jìn)行了功能研究。本研究主要結(jié)果如下:(1)采用Illumina Hiseq 2500平臺對20%PEG脅迫6 h的根系及對照進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,共得到了32.99 Gb數(shù)據(jù),超過40M條長125bp的pair-end reads。有5246個差異表達(dá)基因,其中2753上調(diào)表達(dá),2493下調(diào)表達(dá)。在差異表達(dá)基因中有5175個基因獲得注釋。GO分析結(jié)果顯示這些差異表達(dá)基因涉及到了信號傳遞、滲透調(diào)節(jié)、活性氧清除、轉(zhuǎn)錄因子、植物激素、蛋白合成和細(xì)胞分裂等過程。在KEGG分析中,825個差異表達(dá)基因可分到108個不同的通路中。核糖體、植物激素信號、植物-病原體互作、嘌呤代謝及淀粉和糖代謝等通路中包含了大部分差異表達(dá)基因,其中核糖體途徑被顯著改變。(2)采用Illumina Hiseq 2500測序平臺對西瓜根系PEG脅迫后其miRNA水平上的響應(yīng)進(jìn)行了研究,同時利用生物信息學(xué)預(yù)測和降解組測序的方法對測序得到的miRNA的靶基因進(jìn)行了預(yù)測。在對照文庫S01、S02、S03和脅迫處理文庫S04、S05S06文庫中分別得到了14,662,351、14,263,084、15,767,557、16,743,057、16,615,676、13,354,601和27,618,848個clean reads,通過質(zhì)量控制,每文庫的Clean Data均大于13.35M,且Q30值均大于91%。在6個樣品中總共預(yù)測到了1060個新miRNA,其長度以24 nt為主。對這1060個miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測,其中174個miRNA預(yù)測到了456個靶基因。在這預(yù)測到的456個靶基因中,有241個基因獲得了注釋信息。差異表達(dá)的miRNA有42,其中上調(diào)表達(dá)的為20個,下調(diào)為22個。在差異表達(dá)表達(dá)miRNA的75個靶基因中,只有14個基因得到了注釋。在降解組文庫中,共檢測到了66個靶基因降解位點和66個靶基因發(fā)生了降解。與miRNA測序預(yù)測的靶基因取交集,得到了28個共有靶基因,這28個共有靶基因涉及了SPL、HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子及植物激素信號傳遞。(3)西瓜植株在PEG脅迫下,其莖和葉中脯氨酸含量逐漸增加,后在12 h下降;而在根中,在第3 h達(dá)到最大,后開始下降。脯氨酸合成相關(guān)酶的酶活性及其編碼基因的相對表達(dá)量結(jié)果表明,PEG脅迫下西瓜植株中脯氨酸合成以谷氨酸途徑為主,在2個P5CS編碼基因中,以Cla006553為主,Cla017928表達(dá)被抑制。P5CS活性變化與Cla006553相對表達(dá)量變化相似。OAT酶活性較小,而其編碼基因的表達(dá)在根、莖葉中均被抑制。截斷地上部和地下部分并進(jìn)行干旱脅迫,其試驗結(jié)果表明葉是脯氨酸合成的主要場所,在脅迫下根中脯氨酸依靠葉中脯氨酸長距離運輸?shù)礁俊la006553和Cla017928的啟動子驅(qū)動GUS的轉(zhuǎn)基因擬南芥脅迫后染色發(fā)現(xiàn),在擬南芥葉中Cla006553的啟動子活性最高,在根中活性低。而Cla017928的啟動子在脅迫后,根、葉中的活性均較低。這更進(jìn)一步表明,PEG脅迫下西瓜主要以Cla006553編碼P5CS酶,脯氨酸以葉為主要合成器官。(4)克隆了西瓜自交系M08的P5CS酶兩個編碼基因:Cla006553和Cla017928。Cla006553的編碼序列長2166bp,編碼721個氨基酸;Cla017928的編碼序列長2145bp,編碼714個氨基酸。二者核酸和氨基酸序列之間相似性為分別為74.19%和77.12%。其蛋白含有谷氨酸激酶功能域、ATP結(jié)合區(qū)、NAD(P)H結(jié)合區(qū)、亮氨酸拉鏈、谷氨酰脫氫酶功能區(qū)(G5PR)等結(jié)構(gòu)域和脯氨酸反饋抑制位點。轉(zhuǎn)Cla006553和Cla017928基因的擬南芥植株可顯著增加脯氨酸含量,具有較高的耐旱和耐鹽能力。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S651

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本文編號：1260898