本文關鍵詞：天蠶素的規(guī)�；苽浼捌湓跀嗄套胸i日糧中的應用研究

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【摘要】：為了給消費者提供優(yōu)質綠色的動物產品,同時提高我國畜產品的國際競爭力,研制抗生素或化學類生長促進劑的替代物是中國飼料添加劑工業(yè)面臨的一個重大課題。目前認為抗生素替代品有很多,如植物提取物、微生態(tài)制劑、酶制劑以及抗菌肽等,抗菌肽的生物學特性:(1)生物學活性范圍廣;(2)作用迅速、效果穩(wěn)定;(3)不易產生耐藥性;(4)對包膜病毒、真菌、癌細胞等均有作用;(5)沒有藥物殘留。天蠶素是從蠶蛹中分離的,屬于首例發(fā)現的動物抗菌肽,在1980年,瑞典科學家G.Boman等人發(fā)現的,定名為cecropins。本論文主要篩選得到高效分泌表達天蠶素的枯草芽孢桿菌宿主菌及其中試發(fā)酵工藝優(yōu)化、天蠶素的發(fā)酵液分離純化和初步應用試驗。論文的主要結果如下:(1)天蠶素在不同枯草芽孢桿菌的表達含量的比較。將表達載體分別轉化入三株宿主菌株后,實現重組天蠶素異源表達,然后用SDS-PAGE和高效液相法比較三株菌株cecropin AD表達量。經SDS-PAGE和高效液相法分析,三株菌株都能產生分子量為3.8 k Da的小肽,但經過比較發(fā)現重組cecropin AD在宿主菌WB800表達效率最高,含量達到826.72μg/ml。(2)將從實驗室篩選得到的宿主菌WB800進行中試發(fā)酵工藝優(yōu)化。本文以枯草芽孢桿菌WB800為供試菌株,依托實驗室前期工作基礎以Design-Expert響應面分析軟件為基礎,通過其Box-Behnken Design(BBD)來設計實驗方法,通過p H值、通風量、轉速三個因變量的分析比較,以最終天蠶素產量為唯一響應值,通過設計實驗方案,找出最佳發(fā)酵工藝條件,為CAD的工業(yè)化生產提供數據支持。通過實驗我們可以得出,當發(fā)酵液的p H值達到7.60,轉速達到230 r/min,其通風量達到5.00L/h的時候,天蠶素表達量會達到一個理論最高值,即979.98μg/ml,通過三次驗證實際含量能達到961.52μg/ml,可以進行產業(yè)化生產。(3)以從第一章獲得的能高表達量天蠶素菌種WB800為宿主菌,以第二章優(yōu)化后的發(fā)酵工藝進行發(fā)酵,獲得待純化的發(fā)酵液;根據天蠶素的理化性質首先設計了純化路線;其次是在純化的每個步驟進行純化填料的摸索、條件優(yōu)化;最后將整個純化工藝進行貫通,純化出天蠶素的純品進行檢測、鑒定。研究表明:發(fā)酵液經過離子交換層析后收集到的樣品用反相色譜的方法檢測純度為69.5%,疏水層析后純度為87.4%,最終檢測天蠶素純品的純度為100%;純品對于G-與G+均有一定的抑制與殺滅作用。(4)將天蠶素飼料添加劑產品加到豬日糧中,觀察其對斷奶仔豬生長性能和免疫功能的影響。選取體重為8.46±0.12 kg的杜×大×長三元雜交豬360頭,采用單因子完全隨機設計,分為4個處理,每個處理6個重復(欄),每個重復(欄)15頭豬,對照組:基礎日糧(無藥物,玉米-豆粕型);藥物組:基礎日糧+25 mg/kg維吉尼亞霉素+100 mg/kg土霉素+60 mg/kg硫酸抗敵素(藥物以有效含量計);天蠶素組:基礎日糧+400 mg/kg天蠶素;配伍組:基礎日糧+250 mg/kg天蠶素+50 mg/kg土霉素+20 mg/kg硫酸抗敵素(藥物以有效含量計),研究天蠶素對斷奶仔豬生產性能和免疫功能的影響。結果表明,天蠶素組及配伍組較抗生素組及對照組在仔豬飼料轉化率方面均差異顯著(P0.05),在日增重及日采食量方面均有改善的趨勢;在腹瀉率及豬瘟抗體水平方面,試驗各組均顯著優(yōu)于對照組(P0.05),其中對于天蠶素組平均抗體阻斷率顯著優(yōu)于其余三個組(P0.05);天蠶素組在血清生化指標BUN、GLU、TP及Ig G、Ig A方面有顯著改善作用(P0.05)。(5)在北京、河北、河南等規(guī)�；i場推廣應用中,在仔豬飼料轉化率方面、成活率和腹瀉率均取得良好應用效果,每頭豬給養(yǎng)殖戶增加經濟效益達13-16元。因此,天蠶素添加到保育豬飼料中可以部分替代吉他霉素、維吉尼亞霉素等抗G+飼用抗生素使用量和降低硫酸粘桿菌素使用量。綜上所述,通過對三株枯草芽孢桿菌篩選獲得了能高效表達天蠶素的菌株WB800,同時通過優(yōu)化發(fā)酵工藝獲得了能產業(yè)化生產的工藝條件,根據天蠶素特點摸索得到最適分離純化工藝,并獲取到100%純品。對斷奶仔豬的應用表明,能有效減少或完全取代抗生素的使用。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S828.5

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