本文關(guān)鍵詞：小麥條銹菌致病相關(guān)基因鑒定及其功能研究

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【摘要】：由條形柄銹菌小麥專化型(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的條銹病是小麥生產(chǎn)上的一種重要真菌病害。目前生產(chǎn)上主要利用抗病品種來(lái)防治小麥條銹病。但是小麥抗病品種容易隨著條銹菌致病性的不斷變異而喪失抗性,導(dǎo)致條銹病持續(xù)威脅著全球小麥生產(chǎn)和糧食安全。因此解析小麥條銹菌的致病及其變異機(jī)制對(duì)開(kāi)發(fā)新的持久防治條銹病策略具有重要意義。本論文在小麥條銹菌全基因組測(cè)序基礎(chǔ)上,對(duì)致病效應(yīng)基因(Effector gene)和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的Ras和激酶基因開(kāi)展研究,明確它們?cè)诓【秩局虏≈械淖饔谩Ｔ撗芯繛槿娼沂拘←湕l銹菌的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ),進(jìn)而為小麥條銹病的持久控制新策略的制定提供重要的理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.效應(yīng)基因的鑒定與功能解析借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的PVX病毒表達(dá)系統(tǒng),在模式植物本氏煙中高通量表達(dá)了26個(gè)小麥條銹菌候選效應(yīng)基因,從中鑒定到了6個(gè)能夠抑制BAX誘導(dǎo)PCD的條銹菌效應(yīng)基因。通過(guò)酵母分泌系統(tǒng)證實(shí)了這6個(gè)效應(yīng)基因編碼的蛋白(效應(yīng)蛋白)均為典型的分泌蛋白。q RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)其中的4個(gè)效應(yīng)基因(Ps4884、Ps4941、Ps5278和Ps5578)在條銹菌侵染小麥過(guò)程中誘導(dǎo)表達(dá),而Ps4593和Ps5086則在其侵染過(guò)程中下調(diào)表達(dá)。小麥條銹菌效應(yīng)基因呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式暗示它們可能在不同侵染時(shí)期發(fā)揮功能。利用細(xì)菌III型分泌系統(tǒng)將這6個(gè)條銹菌效應(yīng)基因在其寄主小麥中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),從而明確了它們的毒性和無(wú)毒性功能。結(jié)果表明除Ps4593之外的5個(gè)效應(yīng)基因均能抑制非病原細(xì)菌激發(fā)的小麥PTI防衛(wèi)反應(yīng),且所有的6個(gè)效應(yīng)基因均能抑制小麥與無(wú)毒性條銹菌菌系互作中的ETI反應(yīng)。這表明鑒定到的小麥條銹菌效應(yīng)基因具有顯著的毒性功能。另一方面,通過(guò)大規(guī)模篩選發(fā)現(xiàn)Ps4884、Ps4941和Ps5578這三個(gè)不同的效應(yīng)基因均能在Yr1近等基因系的小麥材料上誘導(dǎo)過(guò)敏性反應(yīng)(HR)類似細(xì)胞壞死,而Ps4941同時(shí)還能在Yr7近等基因系的小麥材料上誘導(dǎo)HR類似細(xì)胞壞死。這些結(jié)果表明Ps4884、Ps4941和Ps5578為候選的條銹菌無(wú)毒基因,也揭示了多個(gè)條銹菌無(wú)毒基因可與同一個(gè)小麥抗病基因識(shí)別,而單個(gè)條銹菌無(wú)毒基因也可與多個(gè)小麥抗病基因識(shí)別。在煙草中對(duì)這6個(gè)小麥條銹菌效應(yīng)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位,發(fā)現(xiàn)它們均位于煙草細(xì)胞內(nèi),屬于典型的胞內(nèi)效應(yīng)蛋白。同時(shí)大豆根部吸收實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小麥條銹菌效應(yīng)蛋白與GFP的融合蛋白在沒(méi)有病原菌介導(dǎo)的情況下能夠進(jìn)入大豆的根尖細(xì)胞,這表明了小麥條銹菌效應(yīng)蛋白可不依賴于病原菌的存在而轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入寄主細(xì)胞內(nèi)。序列分析發(fā)現(xiàn)這6個(gè)效應(yīng)蛋白均不含卵菌效應(yīng)蛋白中負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)的RXLR基序,推測(cè)小麥條銹菌效應(yīng)蛋白與卵菌效應(yīng)蛋白具有不同的轉(zhuǎn)運(yùn)方式。禾谷類白粉菌中預(yù)測(cè)的Y/F/Wx C基序在其中的4個(gè)小麥條銹菌效應(yīng)蛋白存在,然而該基序的突變體并不能改變其小麥條銹菌效應(yīng)蛋白在煙草中的亞細(xì)胞定位和抑制BAX誘導(dǎo)PCD的毒性功能。這表明Y/F/Wx C基序并不負(fù)責(zé)小麥條銹菌效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和毒性功能。2.關(guān)鍵效應(yīng)基因的靶標(biāo)鑒定在之前鑒定得到的6個(gè)小麥條銹菌效應(yīng)基因中,我們選取了兩個(gè)關(guān)鍵的效應(yīng)基因進(jìn)行毒性機(jī)制研究。Ps KE1(Ps5578)和Ps KE2(Ps4941)具有相似的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平和毒性功能。分析發(fā)現(xiàn)它們雖然在蛋白序列上具有較低的相似性,但在蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)上具有較高的相似性。利用寄主誘導(dǎo)的基因沉默(HIGS)技術(shù)將它們沉默后會(huì)導(dǎo)致條銹菌在寄主小麥上的致病表型減弱。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)沉默植株中條銹菌的菌絲發(fā)育受到抑制,同時(shí)寄主植物的防衛(wèi)反應(yīng)增強(qiáng)。這些結(jié)果表明Ps KE1和Ps KE2很可能通過(guò)抑制植物的防衛(wèi)反應(yīng)來(lái)參與條銹菌在小麥上的毒性。利用酵母雙雜的方法,篩選到三個(gè)來(lái)自不同家族的小麥靶標(biāo)蛋白與Ps KE1蛋白進(jìn)行互作,分別為T(mén)a PKDM7-1、Ta Trx-m4和Ta DHN-1。同時(shí)Ta PKDM7-1和Ta Trx-m4也能與Ps KE2蛋白進(jìn)行互作。進(jìn)一步的酵母雙雜實(shí)驗(yàn)表明Ps KE1不能與Ps KE2互作,而這三個(gè)小麥靶標(biāo)蛋白之間也無(wú)明顯的互作。對(duì)效應(yīng)蛋白和靶標(biāo)蛋白在小麥原生質(zhì)體中進(jìn)行亞細(xì)胞定位,發(fā)現(xiàn)Ps KE1和Ps KE2均定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,而Ta PKDM7-1、Ta Trx-m4和Ta DHN-1也分別定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。這些結(jié)果證實(shí)了這兩個(gè)條銹菌效應(yīng)蛋白與其小麥靶標(biāo)蛋白在細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核中進(jìn)行互作的可能性。而雙分子熒光互補(bǔ)(BIFC)實(shí)驗(yàn)證明了這兩個(gè)條銹菌效應(yīng)蛋白與其小麥靶標(biāo)蛋白確實(shí)能在植物體內(nèi)互作。q RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)這三個(gè)小麥靶標(biāo)基因均受條銹菌侵染誘導(dǎo)表達(dá),且表達(dá)高峰期與Ps KE1和Ps KE2的高峰期一致。利用病毒介導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)沉默這三個(gè)小麥靶標(biāo)后導(dǎo)致條銹菌致病表型減弱。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)沉默植株中的條銹菌菌絲發(fā)育受到抑制,同時(shí)其寄主防衛(wèi)反應(yīng)增強(qiáng)。這些結(jié)果表明這三個(gè)小麥靶標(biāo)基因很可能通過(guò)抑制植物的防衛(wèi)反應(yīng)來(lái)參與小麥對(duì)條銹菌的感病性。3.明確兩個(gè)不同Ras基因在致病性和細(xì)胞程序性死亡中的分化功能在小麥條銹菌基因組鑒定了兩個(gè)不同的Ras基因,Ps Ras1和Ps Ras2。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)小麥條銹菌的兩個(gè)Ras基因?qū)儆趦蓚�(gè)不同的進(jìn)化分支。和其它絲狀真菌的Ras2蛋白相比,禾谷類銹菌和同屬擔(dān)子菌的玉米瘤黑粉菌的Ras2蛋白有明顯的序列缺失。q RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)Ps Ras1和Ps Ras2具有不同的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特征,分別在條銹菌侵染小麥過(guò)程中下調(diào)和上調(diào)表達(dá)。利用HIGS技術(shù)分別將Ps Ras1和Ps Ras2進(jìn)行沉默,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ps Ras1和Ps Ras2沉默植株的吸器數(shù)目都減少,然而侵染菌絲的長(zhǎng)度只在Ps Ras2沉默植株上變短,在Ps Ras1沉默植株上無(wú)明顯變化。最終的致病表型也只在Ps Ras2沉默植株上減弱,在Ps Ras1沉默植株上無(wú)明顯變化。這表明與Ps Ras1相比,Ps Ras2在條銹菌的致病性中起著更加重要的作用。然而將條銹菌Ras基因與小麥赤霉菌ras2突變體進(jìn)行互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Ps Ras2并不能恢復(fù)赤霉菌ras2突變體在菌絲生長(zhǎng)方面的缺陷。這表明小麥條銹菌和赤霉菌的Ras2基因在功能上的差異性。Ps Ras1雖在小麥條銹菌的致病性中起著較小的作用,但將其在植物系統(tǒng)中瞬時(shí)表達(dá)后能夠引起植物的細(xì)胞程序性死亡(PCD),Ps Ras2則不能。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),Ps Ras1蛋白中所有Ras蛋白保守結(jié)構(gòu)域均負(fù)責(zé)PCD的誘導(dǎo)。同時(shí)Ps Ras1誘導(dǎo)的植物PCD表現(xiàn)出和植物HR類似的細(xì)胞學(xué)特征,并依賴于植物的一個(gè)MAPK級(jí)聯(lián)途徑,該MAPK級(jí)聯(lián)途徑已知也參與了植物HR。這些結(jié)果表明Ps Ras1誘導(dǎo)的植物PCD和植物HR具有類似的機(jī)制。4.禾谷類銹菌特有激酶基因Ps SRPKL是小麥條銹菌重要的致病因子在小麥條銹菌吸器庫(kù)中鑒定到了一個(gè)新穎的激酶基因Ps SRPKL。q RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)Ps SRPKL在條銹菌侵染小麥過(guò)程中高量誘導(dǎo)表達(dá),同時(shí)也在侵染轉(zhuǎn)主寄主小檗中誘導(dǎo)表達(dá)。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)Ps SRPKL屬于禾谷類銹菌進(jìn)化上特有的激酶基因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Ps SRPKL具有高水平的種內(nèi)序列多態(tài)性,且突變氨基酸集中于其激酶結(jié)構(gòu)域。同時(shí)在煙草和擬南芥中的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)Ps SRPKL定位于細(xì)胞核。在裂殖酵母中過(guò)表達(dá)Ps SRPKL后會(huì)引起酵母細(xì)胞的形態(tài)畸形,同時(shí)降低酵母細(xì)胞對(duì)環(huán)境脅迫(包括氧脅迫和高滲脅迫)的抗性。利用HIGS技術(shù)將Ps SRPKL進(jìn)行沉默,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ps SRPKL沉默植株的條銹菌致病表型減弱。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)沉默植株中的條銹菌的菌絲發(fā)育受到抑制,同時(shí)寄主植物的活性氧積累增加。這些結(jié)果表明Ps SRPKL是一個(gè)重要的條銹菌致病因子,通過(guò)調(diào)控菌絲發(fā)育和環(huán)境脅迫抗性來(lái)參與條銹菌在小麥上的致病性。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S435.121.42

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 厲曉東;盧建平;李海嬌;林福呈;;絲狀真菌的細(xì)胞凋亡[J];微生物學(xué)通報(bào);2011年02期

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本文編號(hào)：1166187