本文關鍵詞：高血壓心肌重構中泛素活化酶的抑制對心肌肥厚的影響和治療研究

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【摘要】：背景和目的:高血壓所致的心肌重構以心臟負荷增加導致的心肌肥厚為主要表現(xiàn)之一。繼發(fā)性心肌肥厚也主要發(fā)生在高血壓性心肌病,肺動脈高壓和慢性充血性心力衰竭中,而心肌肥厚又明顯增加心律失常、心衰、及猝死率。心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機制十分復雜,目前的藥物對抗心肌肥厚的作用欠佳,探索抑制心肌肥厚甚至逆轉心肌肥厚的新機制和治療藥物,是全世界醫(yī)療工作者面臨的重要課題和研究方向。泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)廣泛存在于心肌組織中負責參與細胞內80%以上蛋白質的降解從而影響心肌重構的過程,已有研究表明部分抑制泛素蛋白酶體活性可以抑制體外心肌細胞的肥厚,因此我們假設抑制處于UPS系統(tǒng)起始位點的關鍵泛素活化酶(UBA1、E1)可能具有更強大的抑制心肌肥厚的作用,本課題的研究目的是明確高血壓所致心肌重構過程中泛素活化酶E1的變化,以及明確抑制E1活性能否抑制體內、體外試驗中血管緊張素II誘導的心肌肥厚,為臨床治療心肌肥厚提供新的研究靶點和治療藥物。方法:臨床資料:臨床心臟瓣膜病患者,開胸接受瓣膜置換手術切取的心耳組織,石蠟切片行免疫組化染色檢測泛素活化酶E1在人體心臟組織的表達情況。體內實驗:選取C57BL/6品系周齡6-8周雄性小鼠,將其隨機分入6組:對照組、血管緊張素II(AngII)埋泵組、E1抑制劑對照組(PYR-41 5mg/kg)、E1抑制劑對照組(PYR-41 10mg/kg)、血管緊張素II埋泵+E1抑制劑治療組(PYR-41 5mg/kg)、血管緊張素II埋泵+E1抑制劑治療組(PYR-41 10mg/kg)。AngII(體內灌注1000ng/kg/min)埋泵建立高血壓心肌肥厚以及抑制劑注射治療心肌肥厚2周后,采用動物心臟超聲檢測小鼠心肌肥厚及心功能情況、熒光麥胚凝集素(wga)染色觀察小鼠心臟組織心肌細胞肥厚及治療情況。體外實驗:選取sd大鼠出生24小時以內的雄性乳鼠,提取乳鼠心肌原代細胞(nrcs)培養(yǎng),將細胞隨機分組培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)皿分8組:對照組、angii組(100nm)、e1抑制劑對照組(5um)、e1抑制劑對照組(10um),angii+e1抑制劑治療組(5um),angii+e1抑制劑治療組(10um),苯腎上腺素(phenylephrine,pe)組、pe+e1抑制劑治療組(5um),pe+e1抑制劑治療組(10um)。藥物刺激24小時后,對各組心肌進行免疫熒光染色測定細胞肥大情況、提取細胞總蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳(westernblot)觀察泛素活化酶(e1)表達水平的改變。提取組織總蛋白行westernblot觀察細胞外信號調節(jié)激酶erk表達水平的改變。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤差表示,統(tǒng)計學差異性p0.05認為差異有統(tǒng)計學意義,采用graphpadprism和spss軟件利用kruskalwallis、onewayanova方法檢測各組數(shù)據(jù)差異性。結果:1.人體心臟組織中泛素活化酶e1廣泛存在,e1也廣泛存在于鼠心肌細胞中。2.angii誘導的小鼠高血壓心肌肥厚3天、7天、14天后,與對照組相比,小鼠心臟組織中泛素活化酶e1表達顯著增高,p0.05。體外angii分別以25nm、50nm、100nm濃度刺激乳鼠心肌細胞,與對照組相比,50nm、100nm濃度刺激組e1表達顯著增高(p0.05)。3.angii刺激血壓升高引起心肌肥厚,與對照組相比,小鼠心重體重比增大、心臟前后壁厚度增厚,左室射血分數(shù)與短軸縮短率下降(p0.05)。angii+e1抑制劑治療組小鼠心重比未見明顯增大、心臟前后壁未見明顯肥厚,左室射血分數(shù)與短軸縮短率與對照組相比未見明顯差異(p0.05)。4.angii泵植入小鼠體內1周后,與對照組相比,angii組動脈收縮壓顯著升高(p0.05),angii+e1抑制劑治療組血壓顯著升高(p0.05),對照組與單純抑制劑對照組相比血壓無差異(p0.05)。5.angii與pe刺激體外心肌細胞肥大,使細胞體積肥大近對照組2倍。與肥大組相比,e1抑制劑在5um和10um濃度下均能顯著抑制心肌細胞肥大(p0.05)。6.angii可引起小鼠體內胞外信號調節(jié)激酶erk磷酸化表達升高,e1抑制劑可顯著抑制磷酸化erk的表達從而抑制心肌肥厚相關的信號通路。結論:1.血管緊張素II誘導的高血壓心肌肥厚過程中,泛素活化酶E1的表達顯著進行性增高。血管緊張素II的刺激劑量與E1的表達增高呈正相關。2.E1特異性抑制劑PYR-41可以抑制高血壓導致的心肌肥厚,同時具有保護心臟功能的作用。E1抑制劑可以抑制體外血管緊張素II、苯腎上腺素引起的心肌細胞肥大。3.血管緊張素II引起的高血壓不能被E1抑制劑降壓,E1抑制劑治療心肌肥厚不是通過降低血壓的作用機制實現(xiàn)的。4.E1抑制劑通過抑制胞外信號調節(jié)激酶ERK磷酸化(p-ERK)是其抑制心肌肥厚的機制之一。
【關鍵詞】：高血壓 心肌肥厚 血管緊張素 II 泛素活化酶 E1 胞外信號調節(jié)激酶
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R544.1;R542.2
【目錄】：

• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 前言14-16
• 材料16-18
• 一、實驗對象16
• 二、實驗材料16-18
• 1、主要抗體16
• 2、主要試劑16-17
• 3、實驗設備17-18
• 方法18-25
• 1. 臨床人體心臟組織樣本的獲取與保存18
• 2. AngII誘發(fā)的體內高血壓心肌肥厚實驗18-19
• 3. 原代心肌細胞培養(yǎng)19
• 4. 體外心肌細胞肥大模型及抑制試驗19-20
• 5. 動脈血壓測定：無創(chuàng)傷尾套法20
• 6. 藥物注射20
• 7. 超聲心動圖檢測20
• 8. 心臟組織取材及病理切片20-21
• 9. 免疫組化染色21
• 10. WGA染色21-22
• 11. 細胞免疫熒光染色22
• 12. 蛋白質提取22-23
• 13. Western Blot23-25
• 結果25-32
• 1. 人體心肌組織和大鼠心肌細胞中泛素活化酶廣泛存在25-26
• 2. AngII誘導的高血壓心肌肥厚過程中泛素活化酶顯著增高26-27
• 3. AngII誘導高血壓所致心肌肥大可被泛素活化酶抑制劑抑制27-31
• 3.1 AngII顯著升高血壓，泛素活化酶抑制劑不具有降壓作用27
• 3.2 體內AngII誘導的高血壓心肌肥厚可被泛素活化酶抑制劑抑制27-30
• 3.3 體外AngII、PE誘導的心肌細胞肥大可被泛素活化酶抑制劑抑制30-31
• 4. 泛素活化酶抑制劑參與抑制ERK信號通路31-32
• 討論32-36
• 結論36-37
• 參考文獻37-42
• 綜述42-54
• 參考文獻49-54
• 攻讀學位期間發(fā)表文章54-55
• 致謝55-56

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1 來松;高血壓心肌重構中泛素活化酶的抑制對心肌肥厚的影響和治療研究[D];大連醫(yī)科大學;2015年

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本文編號：805984