目的:發(fā)展一種基于微流控芯片的集成式數(shù)字化等溫?cái)U(kuò)增分析方法,并將其應(yīng)用于大腸埃希菌尿路感染的快速診斷。方法:研究設(shè)計(jì)并加工了一種集成核酸提取、液滴樣品分散和數(shù)字化等溫?cái)U(kuò)增的微流控芯片。芯片核酸提取結(jié)合液滴與磁珠技術(shù),借助于磁力驅(qū)動磁珠依次通過含有樣品裂解/結(jié)合緩沖液、洗滌液、洗脫液和反應(yīng)液的一系列微池,完成細(xì)胞裂解、核酸結(jié)合、洗滌和洗脫等一系列步驟,之后將核酸提取液與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）反應(yīng)液混合;繼而,將生成的反應(yīng)混合液采用負(fù)壓驅(qū)動的流體剪切方式分散為大規(guī)模液滴體系并收集于反應(yīng)池中;最后,在65℃等溫條件下對反應(yīng)池中液滴內(nèi)核酸進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)后通過熒光呈像確定擴(kuò)增反應(yīng)陽性液滴的比例,依此使用Poisson分布算法推算出樣品中待檢靶標(biāo)的數(shù)量。研究首先以大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行了分析方法發(fā)展與優(yōu)化,之后以批量尿路感染病人尿液樣本驗(yàn)證分析方法的實(shí)際應(yīng)用可行性。結(jié)果:本研究發(fā)展的集成式微流控芯片數(shù)字化等溫?cái)U(kuò)增分析方法能夠以“樣品進(jìn)-結(jié)果出”的方式完成病原細(xì)菌定性和定量檢測。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,整個(gè)分析過程可在2.5 h時(shí)間內(nèi)完成。該方法的檢測動態(tài)范圍跨越4個(gè)數(shù)量級,在2.36?10

【文章來源】：廣州醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

微流控芯片整體結(jié)構(gòu)

單個(gè)分析單元

廣州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文12芯片設(shè)計(jì)包含三層結(jié)構(gòu)，頂層包含核酸提取模塊的的裂解池、洗滌池、洗脫池、反應(yīng)池、油相儲存池，中間層包含數(shù)字化核酸分析單元的液滴發(fā)生器與液滴反應(yīng)池，底層是無結(jié)構(gòu)平板玻璃。微流控芯片每個(gè)分析單元包含上游的核酸提取模塊和下游的數(shù)字化液滴分析模塊(圖2)。核酸提取單元以狹縫串聯(lián)的4個(gè)微池，分別用來承載裂解液/磁珠、洗滌液、洗脫液和反應(yīng)液。數(shù)字化液滴分析模塊包含液滴發(fā)生器以及下游的液滴反應(yīng)池。液滴發(fā)生器的水相通道入口與核酸提取模塊洗脫池底部對接，而油相通道與儲油微池連接。在液滴收集池出口處施加負(fù)壓時(shí)，油相和水相溶液共同進(jìn)入通道，在液滴發(fā)生器處水相在油相的剪切力作用下被切割成微小液滴，進(jìn)入下游的液滴反應(yīng)池。完成液滴樣品分散后，芯片反應(yīng)池中的液滴在65℃下進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。2.1.2芯片加工2.1.2.1核酸提取單元使用AB膠制作條形通道模具（圖3），主要是用于連接各個(gè)儲液池形成磁珠運(yùn)輸通道。制作流程如下:(1)將A、B兩種膠按照1:1的比例混勻;(2)將混合好的AB膠均勻涂至固定好位置的漆包線上;(3)120℃加熱1h固化AB膠;(4)除去多余的漆包線;(5)用手術(shù)刀將通道削成長約4cm、高約1mm、寬約2mm通道;(6)用10:1比例的PDMS前體-引發(fā)劑預(yù)混物倒模，80℃加熱15min取出;(7)按標(biāo)記好的位置打孔，樣品池直徑13mm，洗滌、洗脫池直徑10mm，反應(yīng)池直徑5mm，儲油池直徑3.5mm。圖3AB膠制作的模具2.1.2.2通道層的加工

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]ITO玻璃電化學(xué)微流控芯片制作及低溫鍵合工藝研究[D]. 祁娜.大連理工大學(xué) 2008



本文編號：3584112