Hog1、Slt2-MAP激酶對梨果蠟質(zhì)及疏水性誘導(dǎo)Alternaria alternata侵染結(jié)構(gòu)分化的調(diào)控作用
發(fā)布時間：2021-10-05 03:18
促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）級聯(lián)信號途徑對病原真菌生長、形態(tài)建成、侵染結(jié)構(gòu)分化、次生代謝、致病性及滲透脅迫響應(yīng)等多種生理功能具有調(diào)節(jié)作用,其調(diào)控作用因病原物種類、互作系統(tǒng)而異。為進(jìn)一步闡明Hog1與Slt2-MAP激酶是否參與及如何調(diào)控Alternaria alternata響應(yīng)梨果表皮疏水性和蠟質(zhì)信號從而啟動侵染的過程,本試驗在藥理學(xué)試驗的基礎(chǔ)上,對梨果致病真菌A.alternata（JT-03）MAPK基因Hog1、Slt2進(jìn)行鑒定、克隆和生物信息學(xué)分析,并構(gòu)建缺失突變株和回復(fù)菌株,從分子水平上系統(tǒng)研究了Hog1和Slt2的生物學(xué)功能及對A.alternata響應(yīng)梨果皮蠟質(zhì)物化信號進(jìn)而啟動侵染的調(diào)控機(jī)制,結(jié)果如下:1.藥理學(xué)結(jié)果表明MAPK特異性的抑制劑SB203580可顯著地抑制梨果蠟質(zhì)和疏水性誘導(dǎo)的A.alternata孢子萌發(fā)及附著胞的形成,同時也減弱了A.alternata對早酥梨的致病能力。2.對Hog1、Slt2-MAP激酶進(jìn)行基因克隆后分別得到大小為1615bp和1747bp的克隆產(chǎn)物AaHog1和...
【文章來源】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)甘肅省
【文章頁數(shù)】：90 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
信號傳導(dǎo)模式圖
Hog1、Slt2-MAP激酶對梨果蠟質(zhì)及疏水性誘導(dǎo)Alternariaalternata侵染結(jié)構(gòu)分化的調(diào)控用19圖2同源重組敲除法示意圖Fig.2Schematicofhomologousrecombinationknockout表4擴(kuò)增AaHog1-up,AaHog1-down,AaSlt2-up和AaSlt2-down基因所用到引物。Table4PrimersusedforamplicationofAaHog1-up,AaHog1-down,AaSlt2-upandAaSlt2-down.GenePrimersequences(5"-3")AaHog1-upF:ACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGATAGCCGCAGCATACCATTR:GATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGCTCCGAGGGATCTTTCTTGTAaHog1-downF:CATGCATGGTTGCCTAACTCGGCGCGCCTTGATGCGGCGGCACAGGAGR:GACGGCCAGTGCCAAGCTTCGGCGCGCCCGGCGGAGGGTAAAGTAGGAAaSlt2-upF:ACAGCTATGACCATGATTACGAATTCCAGAAGTGGCGATTGTGGGCR:GATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGCAGGAGTCGAGCAGCAGAGAaSlt2-downF:TTGCCTAACTCGGCGCGCCGAAGCTTAGAGCGTGAAGGATTTGGGTAR:GTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTATCACATCAGCAGCGGAGAA2.2.9.1線性化載體的制備構(gòu)建線性化目的基因敲除載體時所用的載體是pCAMBIA1300（Neo），接下來用Sac-Ⅰ和Xba-Ⅰ分別單酶切載體，酶切體系為150μL：80μLNeo，3μLSac-Ⅰ，3μLXba-Ⅰ，15μL10×buffer，49μLddH20，反應(yīng)條件為37℃，2h。2.2.9.2上下同源臂與pCHPH的重組反應(yīng)將上下同源臂的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與酶切產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳檢測后進(jìn)行膠回收，然后根據(jù)所得膠回收產(chǎn)物濃度計算目的基因反應(yīng)體系，體系如下：3μL目的片段，1.5μL線性載體，4μL5×CEⅡbuffer，2μLExnaseⅡ，9.5μLddH20。在37℃反應(yīng)30min即可完成重組反應(yīng)，從而實現(xiàn)兩線性化DNA的體外環(huán)化。2.2.9.3基因敲除載體的轉(zhuǎn)化將重組產(chǎn)物與大腸桿菌感受態(tài)DH5α混合后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，步驟同2.2.7.3。
Hog1、Slt2-MAP激酶對梨果蠟質(zhì)及疏水性誘導(dǎo)Alternariaalternata侵染結(jié)構(gòu)分化的調(diào)控用21經(jīng)過44h后，觀察玻璃紙上是否有白色菌絲長出，從長出來的平板上揭下該玻璃紙后將其轉(zhuǎn)移到含有潮霉素B（40μg/mL）和羧芐青霉素鈉（500μg/mL）的PDA固體培養(yǎng)基平板上，并繼續(xù)放在28°C恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行正常的培養(yǎng)。培養(yǎng)至2~3d后，觀察是否有長出轉(zhuǎn)化子。若有轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)則將其從玻璃紙上挑取出來，轉(zhuǎn)移到新的PDA固體培養(yǎng)基平板（含潮霉素250μg/mL，羧芐青霉素鈉500μg/mL）上培養(yǎng)2~3d。接下來將轉(zhuǎn)化子在含抗生素和不含抗生素的平板上反復(fù)交替接種3次，以確保抗性遺傳穩(wěn)定性。2.2.11轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定2.2.11.1基因敲除突變株的PCR鑒定圖3轉(zhuǎn)化子驗證方法和引物位置示意圖.Fig.3Schematicofthemethodoftransformantsscreeningandthelocationsoftheprimersused表5基因敲除實驗中鑒定各突變株所使用的引物序列.Table5TheprimersusedforidentificationofthemutantsofthePCRproductinthegeneknockout.assayGenePrimersequences(5"-3")AaHog1-up-F1TCGGGTGGGTTACAACAGAAAaHog1-down-R1GTCCCTCCTGGTTCTTTAGCAaSlt2-up-F1TCGGAGAAGGAGTCTATGGTGAaSlt2-down-R1CCACATCACTGTTCTGTTACGCTrpCFTAGAGTAGATGCCGACCGGOliCRCTGAAAGCACGAGATTCTTC由于野生型中不存在HPH（olic-Hph-trpc）片段，因此用圖3中所示的引物（引物序列如表5所示）不能擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶，而突變株可得到相應(yīng)大小的條帶，因此利用這一差異進(jìn)行突變株的鑒定。ΔAaHog1與ΔAaSlt2用AaHog1-up-F1/OliC-R和
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]果蔬制品中鏈格孢霉毒素檢測與控制研究進(jìn)展[J]. 王琦,蔡瑞,王周利,岳田利,崔璐. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報. 2020(01)
[2]白念珠菌Ras/cAMP/PKA途徑研究進(jìn)展[J]. 黃倩,管國波,黃廣華,魏羽佳. 菌物研究. 2019(04)
[3]辣椒疫霉MAPK基因家族的鑒定及生物信息學(xué)分析[J]. 朱彤彤,楊磊,孫文秀. 生物技術(shù). 2018(05)
[4]采后亞精胺處理對‘早酥梨’黑斑病的控制及貯藏品質(zhì)的影響[J]. 胡培芳,李永才,馬岳岳,畢陽,張婷婷,張彥東. 果樹學(xué)報. 2018(02)
[5]采后亞硒酸鈉處理對杏果黑斑病的控制及貯藏品質(zhì)的影響[J]. 高春麗,李永才,畢陽,劉筱,楊蘭,喬文景,王迪,唐瑛. 食品科學(xué). 2016(14)
[6]植物病原真菌致病機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 高芬,褚建梅,李靜虹,王夢亮. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2014(05)
[7]植物病原真菌中MAPK級聯(lián)通路研究進(jìn)展[J]. 彭靜靜. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué). 2014(09)
[8]玉米大斑病菌MAPK超家族的全基因組鑒定及途徑模型建立[J]. 鞏校東,張曉玉,田蘭,王星懿,李坡,張盼,王玥,范永山,韓建民,谷守芹,董金皋. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2014(09)
[9]稻曲病菌UvHog1基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 饒玉春,丁正中,陳析豐,曾大力,馬伯軍,顧志敏. 中國水稻科學(xué). 2014(01)
[10]MAPK信號通路研究進(jìn)展[J]. 陳建勇,王聰,王娟,曹禮榮. 中國醫(yī)藥科學(xué). 2011(08)
博士論文
[1]稻瘟病菌G蛋白及MAPK信號途徑相關(guān)基因的功能分析[D]. 張海峰.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
碩士論文
[1]基于蘋果梨果皮含量水平的酚類物質(zhì)對Alternaria alternata侵染及胞外降解酶的調(diào)控[D]. 劉筱.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[2]發(fā)育及貯藏期蘋果梨果皮蠟質(zhì)對Alternaria alternata侵染的影響[D]. 唐瑛.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[3]橡膠樹白粉菌致病相關(guān)基因及Mapk途徑相關(guān)基因的克隆和定量分析[D]. 孫雅琦.海南大學(xué) 2015
[4]灰葡萄孢胞壁降解酶、角質(zhì)酶及其對番茄植株的致病作用[D]. 吳潔云.揚(yáng)州大學(xué) 2007
本文編號：3418893
【文章來源】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)甘肅省
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【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
信號傳導(dǎo)模式圖
Hog1、Slt2-MAP激酶對梨果蠟質(zhì)及疏水性誘導(dǎo)Alternariaalternata侵染結(jié)構(gòu)分化的調(diào)控用19圖2同源重組敲除法示意圖Fig.2Schematicofhomologousrecombinationknockout表4擴(kuò)增AaHog1-up,AaHog1-down,AaSlt2-up和AaSlt2-down基因所用到引物。Table4PrimersusedforamplicationofAaHog1-up,AaHog1-down,AaSlt2-upandAaSlt2-down.GenePrimersequences(5"-3")AaHog1-upF:ACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGATAGCCGCAGCATACCATTR:GATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGCTCCGAGGGATCTTTCTTGTAaHog1-downF:CATGCATGGTTGCCTAACTCGGCGCGCCTTGATGCGGCGGCACAGGAGR:GACGGCCAGTGCCAAGCTTCGGCGCGCCCGGCGGAGGGTAAAGTAGGAAaSlt2-upF:ACAGCTATGACCATGATTACGAATTCCAGAAGTGGCGATTGTGGGCR:GATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGCAGGAGTCGAGCAGCAGAGAaSlt2-downF:TTGCCTAACTCGGCGCGCCGAAGCTTAGAGCGTGAAGGATTTGGGTAR:GTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTATCACATCAGCAGCGGAGAA2.2.9.1線性化載體的制備構(gòu)建線性化目的基因敲除載體時所用的載體是pCAMBIA1300（Neo），接下來用Sac-Ⅰ和Xba-Ⅰ分別單酶切載體，酶切體系為150μL：80μLNeo，3μLSac-Ⅰ，3μLXba-Ⅰ，15μL10×buffer，49μLddH20，反應(yīng)條件為37℃，2h。2.2.9.2上下同源臂與pCHPH的重組反應(yīng)將上下同源臂的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與酶切產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳檢測后進(jìn)行膠回收，然后根據(jù)所得膠回收產(chǎn)物濃度計算目的基因反應(yīng)體系，體系如下：3μL目的片段，1.5μL線性載體，4μL5×CEⅡbuffer，2μLExnaseⅡ，9.5μLddH20。在37℃反應(yīng)30min即可完成重組反應(yīng)，從而實現(xiàn)兩線性化DNA的體外環(huán)化。2.2.9.3基因敲除載體的轉(zhuǎn)化將重組產(chǎn)物與大腸桿菌感受態(tài)DH5α混合后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，步驟同2.2.7.3。
Hog1、Slt2-MAP激酶對梨果蠟質(zhì)及疏水性誘導(dǎo)Alternariaalternata侵染結(jié)構(gòu)分化的調(diào)控用21經(jīng)過44h后，觀察玻璃紙上是否有白色菌絲長出，從長出來的平板上揭下該玻璃紙后將其轉(zhuǎn)移到含有潮霉素B（40μg/mL）和羧芐青霉素鈉（500μg/mL）的PDA固體培養(yǎng)基平板上，并繼續(xù)放在28°C恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行正常的培養(yǎng)。培養(yǎng)至2~3d后，觀察是否有長出轉(zhuǎn)化子。若有轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)則將其從玻璃紙上挑取出來，轉(zhuǎn)移到新的PDA固體培養(yǎng)基平板（含潮霉素250μg/mL，羧芐青霉素鈉500μg/mL）上培養(yǎng)2~3d。接下來將轉(zhuǎn)化子在含抗生素和不含抗生素的平板上反復(fù)交替接種3次，以確保抗性遺傳穩(wěn)定性。2.2.11轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定2.2.11.1基因敲除突變株的PCR鑒定圖3轉(zhuǎn)化子驗證方法和引物位置示意圖.Fig.3Schematicofthemethodoftransformantsscreeningandthelocationsoftheprimersused表5基因敲除實驗中鑒定各突變株所使用的引物序列.Table5TheprimersusedforidentificationofthemutantsofthePCRproductinthegeneknockout.assayGenePrimersequences(5"-3")AaHog1-up-F1TCGGGTGGGTTACAACAGAAAaHog1-down-R1GTCCCTCCTGGTTCTTTAGCAaSlt2-up-F1TCGGAGAAGGAGTCTATGGTGAaSlt2-down-R1CCACATCACTGTTCTGTTACGCTrpCFTAGAGTAGATGCCGACCGGOliCRCTGAAAGCACGAGATTCTTC由于野生型中不存在HPH（olic-Hph-trpc）片段，因此用圖3中所示的引物（引物序列如表5所示）不能擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶，而突變株可得到相應(yīng)大小的條帶，因此利用這一差異進(jìn)行突變株的鑒定。ΔAaHog1與ΔAaSlt2用AaHog1-up-F1/OliC-R和
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]果蔬制品中鏈格孢霉毒素檢測與控制研究進(jìn)展[J]. 王琦,蔡瑞,王周利,岳田利,崔璐. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報. 2020(01)
[2]白念珠菌Ras/cAMP/PKA途徑研究進(jìn)展[J]. 黃倩,管國波,黃廣華,魏羽佳. 菌物研究. 2019(04)
[3]辣椒疫霉MAPK基因家族的鑒定及生物信息學(xué)分析[J]. 朱彤彤,楊磊,孫文秀. 生物技術(shù). 2018(05)
[4]采后亞精胺處理對‘早酥梨’黑斑病的控制及貯藏品質(zhì)的影響[J]. 胡培芳,李永才,馬岳岳,畢陽,張婷婷,張彥東. 果樹學(xué)報. 2018(02)
[5]采后亞硒酸鈉處理對杏果黑斑病的控制及貯藏品質(zhì)的影響[J]. 高春麗,李永才,畢陽,劉筱,楊蘭,喬文景,王迪,唐瑛. 食品科學(xué). 2016(14)
[6]植物病原真菌致病機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 高芬,褚建梅,李靜虹,王夢亮. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2014(05)
[7]植物病原真菌中MAPK級聯(lián)通路研究進(jìn)展[J]. 彭靜靜. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué). 2014(09)
[8]玉米大斑病菌MAPK超家族的全基因組鑒定及途徑模型建立[J]. 鞏校東,張曉玉,田蘭,王星懿,李坡,張盼,王玥,范永山,韓建民,谷守芹,董金皋. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2014(09)
[9]稻曲病菌UvHog1基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 饒玉春,丁正中,陳析豐,曾大力,馬伯軍,顧志敏. 中國水稻科學(xué). 2014(01)
[10]MAPK信號通路研究進(jìn)展[J]. 陳建勇,王聰,王娟,曹禮榮. 中國醫(yī)藥科學(xué). 2011(08)
博士論文
[1]稻瘟病菌G蛋白及MAPK信號途徑相關(guān)基因的功能分析[D]. 張海峰.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
碩士論文
[1]基于蘋果梨果皮含量水平的酚類物質(zhì)對Alternaria alternata侵染及胞外降解酶的調(diào)控[D]. 劉筱.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[2]發(fā)育及貯藏期蘋果梨果皮蠟質(zhì)對Alternaria alternata侵染的影響[D]. 唐瑛.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[3]橡膠樹白粉菌致病相關(guān)基因及Mapk途徑相關(guān)基因的克隆和定量分析[D]. 孫雅琦.海南大學(xué) 2015
[4]灰葡萄孢胞壁降解酶、角質(zhì)酶及其對番茄植株的致病作用[D]. 吳潔云.揚(yáng)州大學(xué) 2007
本文編號：3418893
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