本文關(guān)鍵詞：ANXA3調(diào)控小鼠肝癌細胞惡性表型分子機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:膜聯(lián)蛋白A3(Annexin A3,ANXA3)是膜聯(lián)蛋白家族成員之一,是Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,有36 k Da和33 k Da兩種亞型,其異常表達與腫瘤發(fā)生發(fā)展、耐藥性和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。小鼠肝癌Hca-F和Hca-P細胞遺傳背景相似但淋巴道轉(zhuǎn)移潛能不同,ANXA3在Hca-F和Hca-P細胞株中均高豐度表達但又有差異,是研究ANXA3與肝癌腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的理想模型。目的:1、構(gòu)建p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa3表達載體,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hca-F和Hca-P細胞,篩選ANXA3穩(wěn)定下調(diào)的Hca-F和Hca-P單克隆細胞株;2、構(gòu)建p EGFP-N1-Anxa3和pc DNA3.1/V5-His B-Anxa3真核表達載體,瞬時轉(zhuǎn)染并在Hca-P細胞中過表達ANXA3;3、考察ANXA3下調(diào)對Hca-F細胞體外增殖、遷移和侵襲的影響;4、考察ANXA3下調(diào)對Hca-P細胞體外增殖、克隆形成、遷移、侵襲及耐藥性的影響;5、研究ANXA3的亞細胞定位;6、考察ANXA3過表達對Hca-P細胞體外增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響;7、系統(tǒng)研究ANXA3調(diào)控Hca-F和Hca-P細胞惡性表型的分子調(diào)控機制。方法:1、利用在線軟件設計Anxa3基因的sh RNA及無關(guān)序列(NC,陰性對照),構(gòu)建p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa3及p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-NC表達載體;2、采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法,將p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa3/NC表達載體轉(zhuǎn)染至Hca-F和Hca-P細胞,G418抗性篩選及有限稀釋法獲得ANXA3穩(wěn)定下調(diào)的單克隆細胞株,計算ANXA3下調(diào)效率;3、自行設計引物,利用基因工程方法構(gòu)建p EGFP-N1-Anxa3和pc DNA3.1/V5-His B-Anxa3過表達載體,瞬時轉(zhuǎn)染Hca-P細胞;4、CCK-8法分析ANXA3下調(diào)對Hca-F和Hca-P細胞,ANXA3過表達對Hca-P細胞增殖能力的影響;軟瓊脂克隆實驗考察ANXA3下調(diào)及過表達對Hca-P細胞克隆形成能力的影響;5、Transwell小室法分析ANXA3的表達對Hca-F和Hca-P細胞遷移侵襲能力的影響;6、CCK-8結(jié)合Hoechst33258凋亡染色分析ANXA3下調(diào)對Hca-P細胞耐藥性及抗順鉑誘導凋亡的影響;7、激光掃描共聚焦實驗確定ANXA3蛋白表達的亞細胞定位;8、Western Blot確定ANXA3調(diào)控Hca-F和Hca-P細胞惡性行為信號轉(zhuǎn)導通路中相關(guān)分子水平變化。結(jié)果:1、成功構(gòu)建p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa3/NC表達載體,獲得ANXA3穩(wěn)定下調(diào)的F-ANXA3-sh RNA、P-ANXA3-sh RNA1和P-ANXA3-sh RNA2單克隆細胞株;2、酶切及測序結(jié)果表明,p EGFP-N1-Anxa3和pc DNA3.1/V5-His B-Anxa3過表達載體構(gòu)建成功;3、F-ANXA3-sh RNA細胞的體外增殖、遷移和侵襲能力分別是陰性對照組的1.62、1.59和2.98倍,ANXA3下調(diào)通過激活Erk通路和PI3K/Akt通路增強Hca-F細胞的惡性表型;4、P-ANXA3-sh RNA1(2)細胞的體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力分別是陰性對照組的1.13(1.08)、4.06(4.86)、4.98(4.75)和2(2.77)倍,ANXA3下調(diào)通過激活Erk和JNK通路增強Hca-P細胞的惡性表型;5、ANXA3過表達后,陰性對照組細胞體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力分別提升為上調(diào)組的1.19、1.32、2.92和3.4倍,ANXA3的過表達通過抑制Erk和JNK通路來抑制Hca-P細胞的惡性表型;6、激光掃描共聚焦實驗結(jié)果表明ANXA3蛋白表達主要集中于細胞質(zhì)中;7、ANXA3下調(diào)增強了Hca-P細胞對順鉑的耐藥性,對5-FU耐藥性無明顯影響,ANXA3通過內(nèi)源性凋亡途徑調(diào)控Hca-P細胞的cisplatin的耐藥性。結(jié)論:1、p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa3/NC、p EGFP-N1-Anxa3和pc DNA3.1/V5-His B-Anxa3真核表達載體成功構(gòu)建;2、獲得了ANXA3表達穩(wěn)定下調(diào)的單克隆細胞株;3、ANXA3的下調(diào)通過激活Erk通路和PI3K/Akt通路促進Hca-F細胞的體外增殖、遷移和侵襲惡性表型;4、ANXA3的下調(diào)增強Hca-P細胞體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力,相反,ANXA3的過表達抑制Hca-P細胞體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力,主要通過調(diào)控Erk和JNK通路來實現(xiàn);5、ANXA3蛋白表達主要集中于細胞質(zhì)中;6、ANXA3下調(diào)通過內(nèi)源性凋亡途徑來提高Hca-P細胞對順鉑耐藥性。
【關(guān)鍵詞】：ANXA3 肝癌 Hca-F Hca-P 增殖 遷移 侵襲 耐藥性
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 第一部分: ANXA3表達下調(diào)增強小鼠肝癌Hca-F細胞惡性表型及分子機制研究16-38
• 一、ANXA3表達穩(wěn)定下調(diào)小鼠肝癌Hca-F細胞株的建立16-23
• 材料和方法16-20
• 結(jié)果20-22
• 討論22-23
• 結(jié)論23
• 二、ANXA3對Hca-F細胞惡性表型的影響及分子機制研究23-34
• 材料和方法23-27
• 結(jié)果27-31
• 討論31-33
• 結(jié)論33-34
• 參考文獻34-38
• 第二部分: ANXA3表達下調(diào)增強小鼠肝癌Hca-P細胞惡性表型及分子機制研究38-60
• 一、ANXA3表達穩(wěn)定下調(diào)小鼠肝癌Hca-P細胞株的建立38-44
• 材料和方法38-40
• 結(jié)果40-43
• 討論43
• 結(jié)論43-44
• 二、ANXA3對Hca-P細胞惡性表型的影響及分子機制研究44-57
• 材料和方法44-47
• 結(jié)果47-54
• 討論54-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻57-60
• 第三部分:ANXA3表達上調(diào)降低Hca-P細胞惡性表型及作用機制研究60-78
• 一、構(gòu)建pEGFP-N1-Anxa3和pc DNA3.1/V5-His B-Anxa3表達質(zhì)粒60-69
• 材料和方法60-67
• 結(jié)果67-68
• 討論68-69
• 結(jié)論69
• 二、ANXA3表達上調(diào)對Hca-P細胞惡性表型的影響及分子機制研究69-77
• 材料和方法69-71
• 結(jié)果71-76
• 討論76
• 結(jié)論76-77
• 參考文獻77-78
• 綜述78-94
• 參考文獻85-94
• 致謝94-95

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉友華;薛社普;;胞質(zhì)因子對人早幼粒白血病細胞惡性表型和基因表達的調(diào)控作用[J];臨床血液學雜志;1988年01期

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本文編號：335145