研究背景:THAP（Thanatos-Associated protein）蛋白家族,因其N端共有一個(gè)在進(jìn)化上高度保守的THAP鋅指結(jié)構(gòu)域而得名。許多THAP蛋白家族成員作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用,參與細(xì)胞的增殖、凋亡、血管生成等過程。THAP8是THAP家族的一個(gè)新成員,其表達(dá)和功能尚不清楚。本文主要研究THAP8基因的表達(dá)、調(diào)控及其功能。研究方法:通過TCGA數(shù)據(jù)庫和Oncomine數(shù)據(jù)庫的分析,發(fā)現(xiàn)THAP8在癌組織中的表達(dá)高于正常組織,然后利用熒光定量PCR分析了22對肺癌和癌旁組織中的THAP8的表達(dá)。利用Western blotting檢測分析THAP8蛋白在人類正常肺細(xì)胞系Beas-2B和幾種肺癌細(xì)胞系中的THAP8蛋白表達(dá)水平。利用過JASPAR軟件分析,發(fā)現(xiàn)THAP8基因啟動(dòng)子區(qū)含有4個(gè)缺氧反應(yīng)元件（HRE）,然后利用熒光素酶實(shí)驗(yàn)和Co Cl2誘導(dǎo)缺氧實(shí)驗(yàn),分析缺氧誘導(dǎo)因子α（HIF1α）對THAP表達(dá)的調(diào)控作用。利用慢病毒系統(tǒng)干擾THAP8基因的表達(dá),采用MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)等分析了THAP8基因沉默對肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。研究結(jié)果:1... 

【文章來源】：湖南師范大學(xué)湖南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

人THAP蛋白家族成員結(jié)構(gòu)模式圖

碩士學(xué)位論文22圖3-1THAP8在肺癌組織中的表達(dá)高于正常肺組織（A、B）利用TCGA數(shù)據(jù)庫（A）及Oncomine數(shù)據(jù)庫(B)分析了在肺癌組織和正常組織中THAP8基因的表達(dá)差異；（C）取22對臨床樣本分析，熒光定量PCR數(shù)據(jù)顯示THAP8基因mRNA水平表達(dá)在肺癌組織和癌旁組織中存在明顯的差異性，用GraphPad軟件分析并計(jì)算具有顯著性差異,N:正常組織，C:癌組織；（D）采用β-actin作為內(nèi)參蛋白，重復(fù)三次用蛋白質(zhì)印記技術(shù)檢測了各肺細(xì)胞系中（95-D、Beas-2B、A549、H358、H446、H1437和H460）THAP8在蛋白水平表達(dá)的差異;（E）用GraphPad軟件分析三次蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果，做灰度統(tǒng)計(jì)分析。

碩士學(xué)位論文24圖3-2HIF1α調(diào)控THAP8基因的表達(dá)（A）表示THAP8基因啟動(dòng)子的部分序列，下劃線標(biāo)示的即是HRE位點(diǎn)；(B)HIF1α對THAP8轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，在Hek293細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，24小時(shí)后進(jìn)行熒光素酶檢測分析；（C）用CoCl2誘導(dǎo)Beas-2B細(xì)胞缺氧，從而誘導(dǎo)HIF1α的表達(dá)，WB檢測THAP8的蛋白表達(dá)變化，用β-actin作為內(nèi)參蛋白。3.3干擾THAP8對肺癌細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲的影響3.3.1干擾THAP8細(xì)胞系的構(gòu)建為了更進(jìn)一步研究THAP8在肺癌中生物學(xué)的功能，我們首先構(gòu)建了THAP8shRNA的表達(dá)載體，并包裝成慢病毒顆粒。共設(shè)計(jì)了四個(gè)靶位點(diǎn)（THAP8基因干擾位點(diǎn)如表3-1所示），首先在95-D細(xì)胞中檢驗(yàn)干擾效果，由于購買的THAP8干擾慢病毒帶有紅色熒光標(biāo)記，因此可在感染72小時(shí)后在熒光顯微鏡觀察感染效率的高低，從而采用適當(dāng)?shù)泥堰拭顾貪舛扰囵B(yǎng)篩選陽性細(xì)胞，最終獲得THAP8低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)株，經(jīng)過反復(fù)的檢測與分析，最終發(fā)現(xiàn)HSH004706-32-LVRH1MP和HSH004706-33-LVRH1MP這兩個(gè)慢病毒的干擾效果最佳（圖3-3A），因此在后文中采用這兩個(gè)慢病毒對THAP8進(jìn)行干擾（分別命名為sh-1和sh-2）。在分析了各種肺癌細(xì)胞系中THAP8基因的表達(dá)情況后，我們選取了THAP8

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]HIF1α和Beclin1在成年牦牛腦組織中的表達(dá)與分布[J]. 拜占春,崔燕,余四九,馬俊興,何俊峰,張倩.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2019(10)
[2]Hypoxia inducible factor（HIF） in the tumor microenvironment:friend or foe?[J]. Yanqing Huang,Daniel Lin,Cullen M.Taniguchi.  Science China（Life Sciences）. 2017(10)



本文編號：3254984