發(fā)布時間：2021-05-06 04:20

　　目的:骨髓間質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMMSC）參與腫瘤微環(huán)境的組成,但p53缺陷的BMMSC(p53^-/-BMMSC)在其中的作用及機制并不清楚,外泌體（exosome）是BMMSC旁分泌的主要成分,p53^-/-BMMSC-exosome在胃癌發(fā)展中的作用尚未報道。本研究旨在揭示p53^-/-BMMSC-exosome內(nèi)的泛素蛋白連接酶E3α2（Ubiquitin ligase E3 alpha II,UBR2）在胃癌發(fā)展中的作用及機制,為胃癌診斷和治療提供新的思路和依據(jù)。方法:采用透射電子顯微鏡觀察p53^+/+mBMMSC（mouse bone marrow mesenchymal stem cell,m BMMSC）和p53^-/-mBMMSC分泌的exosome形態(tài)和直徑大小;通過Nanosight納米顆粒分析儀對p53^+/+m BMMSC和p53^-/-mBMMSC分泌的exo... 

【文章來源】：江蘇大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：86 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞中英文注釋表
第一章 緒論
    1.1 概述
    1.2 間質(zhì)干細胞
        1.2.1 間質(zhì)干細胞的特性
        1.2.2MSC與腫瘤微環(huán)境
        1.2.3 MSC與p53
    1.3 Exosome
        1.3.1 Exosome的生物學特性、生成與釋放
        1.3.2 Exosome的結構和來源
        1.3.3 Exosome與腫瘤
    1.4 UBR2蛋白及功能
    1.5 研究目的、方法、技術路線和意義
        1.5.1 研究目的
        1.5.2 研究方法
        1.5.3 技術路線
        1.5.4 研究意義
第二章 mBMMSC分泌Exosome的鑒定與比較
    2.1 材料
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要的儀器及相關耗材
    2.2 方法
        2.2.1 mBMMSC的分離與培養(yǎng)
        2.2.2 細胞凍存
        2.2.3 細胞復蘇
        2.2.4 去除exosome胎牛血清制備
        2.2.5 細胞上清制備
        2.2.6 細胞上清exosome提取
        2.2.7 透射電鏡觀察exosome的形態(tài)
        2.2.8 Nanosight分析exosome的數(shù)量及大小
        2.2.9 Western blot檢測exosome標志物
        2.2.10 統(tǒng)計分析
    2.3 結果
        2.3.1 透射電鏡鑒定p53~(+/+)mBMMSC和p53~(-/-)mBMMSC來源的exosome
        2.3.2 Nanosight納米顆粒跟蹤分析儀鑒定細胞來源的exosome
        2.3.3 Western blot檢測p53~(+/+)mBMMSC和p53~(-/-)mBMMSC上清來源的exosome表面標記
    2.4 討論
第三章 P53~(-/-)mBMMSC-Exosome在胃癌發(fā)展中的作用
    3.1 材料
        3.1.1 動物
        3.1.2 試劑
        3.1.3 主要的儀器與相關器材
    3.2 方法
        3.2.1 激光共聚焦顯微鏡觀察exosome細胞內(nèi)定位
        3.2.2 流式成像技術檢測exosome細胞內(nèi)定位
        3.2.3 平板克隆增殖實驗
        3.2.4 Transwell遷移實驗
        3.2.5 總RNAs的提取
        3.2.6 RNA逆轉錄
        3.2.7 實時熒光定量PCR
        3.2.8 細胞蛋白的提取
        3.2.9 Western blot
        3.2.10 裸鼠皮下瘤模型構建
        3.2.11 免疫組化檢測及結果判斷
    3.3 結果
        3.3.1 p53~(-/-)mBMMSC-exosome對p53~(+/+)mBMMSC生物學功能的影響
            3.3.1.1 p53~(+/+)mBMMSC內(nèi)化p53~(-/-)mBMMSC-exosome
            3.3.1.2 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促進p53~(+/+)mBMMSC的增殖
            3.3.1.3 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促進p53~(+/+)mBMMSC干性基因的表達
            3.3.1.4 p53~(-/-)mBMMSC-exosome提高p53~(+/+)mBMMSC的遷移能力
            3.3.1.5 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促進p53~(+/+)mBMMSC細胞的EMT
            3.3.1.6 p53~(-/-)mBMMSC-exosome誘導后的p53~(+/+)mBMMSC促進胃癌體內(nèi)成瘤能力
        3.3.2 p53~(-/-)mBMMSC-exosome對MFC生物學功能的影響
            3.3.2.1 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促進MFC的增殖
            3.3.2.2 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促進MFC干性基因的表達
            3.3.2.3 p53~(-/-)mBMMSC-exosome提高MFC的遷移能力
            3.3.2.4 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促進MFC的EMT
            3.3.2.5 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促進MFC體內(nèi)成瘤能力
    3.4 討論
第四章 UBR2在胃癌進展中的作用
    4.1 材料
        4.1.1 動物
        4.1.2 試劑
        4.1.3 主要的儀器與相關器材
    4.2 方法
        4.2.1 RNA的提取、逆轉錄、熒光定量PCR
        4.2.2 細胞蛋白提取、Western blot
        4.2.3 免疫組化
        4.2.4 Nanosight分析exosome的數(shù)量
        4.2.5 Exosome內(nèi)總RNA的提取
        4.2.6 UBR2干擾
        4.2.7 平板克隆增殖實驗
        4.2.8 Transwell遷移實驗
    4.3 結果
        4.3.1 p53~(-/-)mBMMSC細胞及其exosome中UBR2表達明顯高于p53~(+/+)mBMMSC
        4.3.2 p53~(-/-)mBMMSC-exosome能傳遞UBR2至p53~(+/+)mBMMSC和MFC
        4.3.3 UBR2蛋白的功能
            4.3.3.1 UBR2干擾抑制exosome的分泌
            4.3.3.2 UBR2干擾降低p53~(-/-)mBMMSC細胞的增殖
            4.3.3.3 UBR2干擾降低p53~(-/-)mBMMSC細胞的干性基因的表達
            4.3.3.4 UBR2干擾抑制p53~(-/-)mBMMSC細胞的遷移能力
            4.3.3.5 UBR2干擾抑制p53~(-/-)mBMMSC細胞的EMT
    4.4 討論
第五章 P53~(-/-)mBMMSC-Exosome內(nèi)UBR2在胃癌發(fā)展中的作用
    5.1 材料
        5.1.1 試劑
        5.1.2 主要的儀器與相關器材
    5.2 方法
        5.2.1 RNA的提取、逆轉錄、熒光定量PCR
        5.2.2 細胞蛋白提取、Western blot
        5.2.3 UBR2干擾
        5.2.4 平板克隆增殖實驗
        5.2.5 Transwell遷移實驗
        5.2.6 Exosome的提取
        5.2.7 免疫熒光
    5.3 結果
        5.3.1 敲減UBR2后的p53~(-/-)mBMMSC-exosome對p53~(+/+)mBMMSC細胞生物學功能的影響
            5.3.1.1 UBR2敲減exosome作用p53~(+/+)mBMMSC后UBR2驗證
            5.3.1.2 UBR2敲減exosome抑制p53~(+/+)mBMMSC的增殖能力
            5.3.1.3 UBR2敲減exosome抑制p53~(+/+)mBMMSC干性基因的表達
            5.3.1.4 UBR2敲減exosome抑制p53~(+/+)mBMMSC的遷移能力
            5.3.1.5 UBR2敲減exosome抑制p53~(+/+)mBMMSC的EMT
        5.3.2 敲減UBR2后p53~(-/-)mBMMSC-exosome對MFC生物學功能的影響
            5.3.2.1 UBR2敲減exosome作用MFC后UBR2表達下調(diào)
            5.3.2.2 UBR2敲減exosome抑制MFC的增殖能力
            5.3.2.3 UBR2敲減exosome抑制MFC的干性基因表達
            5.3.2.4 UBR2敲減exosome抑制MFC的遷移能力
            5.3.2.5 UBR2敲減exosome抑制MFC的EMT
        5.3.3 UBR2對Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控
    5.4 討論
第六章 結論與展望
    6.1 結論
    6.2 展望
參考文獻
致謝
攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文及參加會議
    一、發(fā)表論文
    二、參加會議
    三、獲獎情況



本文編號：3171225