背景:網(wǎng)膜素是一種新型脂肪因子,也被稱為腸凝集素-1（Intelectin-1,ITLN-1）。ITLN-1不僅與肥胖癥、糖尿病等疾病關(guān)系密切,其在抗炎癥、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抑制腫瘤細(xì)胞增殖中的突出作用也得到眾多科研工作者的關(guān)注。有研究表明缺血性腦卒中穩(wěn)定斑塊組患者血清的ITLN-1水平高于不穩(wěn)定頸動(dòng)脈斑塊組。不同個(gè)體間的ITLN-1水平具有著明顯差異。ITLN-1在人內(nèi)皮細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞以及結(jié)腸、卵巢、肺和胎盤等組織中均有不同程度的表達(dá),但在皮下脂肪中檢測不到。因此研究人ITLN-1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制將有重要的研究意義。DNA pull down是一種基于DNA短片段擁有對(duì)DNA結(jié)合蛋白的高親和力位點(diǎn)并借助生物素/鏈霉親和素純化系統(tǒng)開發(fā)出的一種技術(shù),廣泛應(yīng)用于DNA-蛋白質(zhì)相互作用的研究中。目的:為進(jìn)一步探索ITLN-1在表達(dá)過程中受到的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,我們使用前期實(shí)驗(yàn)確定出的ITLN-1核心啟動(dòng)子區(qū)序列為DNA探針進(jìn)行DNA pull down實(shí)驗(yàn)。對(duì)結(jié)合在該序列的蛋白質(zhì)進(jìn)行富集,結(jié)合生信分析篩選出轉(zhuǎn)錄因子,通過小干擾RNA和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)初步確定出該轉(zhuǎn)錄因子對(duì)ITLN-1表達(dá)... 

【文章來源】： 牛曉晨 延安大學(xué)

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

（1）（2）瓊脂糖凝膠電泳對(duì)目的探針進(jìn)行分離、純化并回收FIG.3-1（1）（2）Separation,purificationandrecoveryofthetargetprobebyagarosegelelectrophoresis

-23-（2）圖3-1（1）（2）瓊脂糖凝膠電泳對(duì)目的探針進(jìn)行分離、純化并回收FIG.3-1（1）（2）Separation,purificationandrecoveryofthetargetprobebyagarosegelelectrophoresis注：純化biotin(0/+296)即對(duì)瓊脂糖凝膠中ITLN-1核心啟動(dòng)子區(qū)序列經(jīng)純化、回收后得到的目的探針。圖3-2通過WB檢測HEK293細(xì)胞核提取物純度Figure3-2DetectionofHEK293nuclearextractpuritybyWB注：GAPDH（37kDa）為胞漿蛋白內(nèi)參;H3，histone（17kDa）核蛋白內(nèi)參

-24-3.1.2pulldown根據(jù)DNAPull-down試劑盒說明書操作，將目的探針和陰性探針分別與核蛋白孵育，下拉，對(duì)下拉產(chǎn)物進(jìn)行PAGE-銀染，銀染結(jié)果如圖3-3（1）所示。在70kDa、100kDa、130kDa處實(shí)驗(yàn)組（DPD1、DPD2）條帶顏色均明顯較對(duì)照組（NC1、NC2）深，其余條帶則無明顯差異。分別將對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組在70kDa、100kDa、130kDa處的條帶切膠送質(zhì)譜檢測，如圖3-3（2）所示。（1）（2）圖3-3（1）（2）DNApulldown產(chǎn)物SDS-PAGE后銀染Figure3-3（1）（2）SilverstainingafterSDS-PAGEofDNApulldownproduct注：Marker為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；NC1為使用陰性探針（NC探針）下拉產(chǎn)物，NC2為其復(fù)孔；DPD1為使用目的探針（DPD探針）下拉產(chǎn)物，DPD2為其復(fù)孔；Input為HEK293細(xì)胞核提取物。N1、N2、N3、D1、D2、D3為NC探針與DPD探針分別下拉產(chǎn)物出現(xiàn)的差異性條帶。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Role of hepatocyte nuclear factor 4-alpha in gastrointestinal and liver diseases[J]. Matthew M Yeh,Dustin E Bosch,Sayed S Daoud.  World Journal of Gastroenterology. 2019(30)



本文編號(hào)：2993649