視網(wǎng)膜變性（Retina degeneration,RD）相關疾病可導致視網(wǎng)膜細胞逐漸丟失,進而發(fā)生視功能障礙甚至致盲。目前視網(wǎng)膜感光細胞的細胞替代治療是較有前景的研究方向,但仍需尋找合適來源的移植細胞和移植手段。為了探究人誘導多能干細胞（human-induced pluripotentstemcells,hiPSCs）體外向視網(wǎng)膜類器官（Retinaorganoids,ROs）的分化進程并進行在體細胞移植的嘗試,我們采用3D培養(yǎng)方法,獲得具有典型視網(wǎng)膜結構的ROs。結合實時熒光定量PCR法和免疫熒光染色,我們系統(tǒng)地鑒定誘導分化進程及效果。形態(tài)學和組織染色結果證明,ROs可模擬人胚胎視網(wǎng)膜發(fā)育進程和經(jīng)典分子標記物的時空表達。我們將ROs在體移植至Gnat1-/-小鼠視網(wǎng)膜內(nèi),觀察其存活及整合情況。結果顯示,ROs細胞移植三周后,自身帶有綠色熒光的細胞成功在宿主小鼠的視網(wǎng)膜外核層中長期存活,移植4-6月后植入細胞表達功能性光信號轉(zhuǎn)導蛋白GNAT1。證實了移植的ROs細胞能在受體小鼠眼內(nèi)長期穩(wěn)定存活,進入外核層并進一步發(fā)育成熟為類感光細胞。另外,在誘導分化前期貼壁培養(yǎng)集落的過程中,我們發(fā)... 

【文章來源】：中國科學技術大學安徽省 211工程院校 985工程院校

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【學位級別】：碩士

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圖１．２光信號轉(zhuǎn)導過程示意圖??（Ｌａ?ｒｅｔｉｎａ，?ｌａ?ｆｏｔｏｔｒａｎｓｄｕｃｃｉｏｎ，?Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ?ｄｅ?Ｃｏｓｔａ?Ｒｉｃａ）??（２）視覺循環(huán)：光異構化將１１－順式視黃醛轉(zhuǎn)化為外段中的所有反式視黃??“”

內(nèi)的具體位置。根據(jù)細胞的功能不同，有些細胞更容易受到一些壓??力的影響。事實上，不僅僅是高度特化的細胞，如參與聽力的毛細胞，或觸摸敏??感的神經(jīng)元能夠感覺這些刺激，其實每個細胞都有感覺和響應機械壓力的能力。??應力通過細胞外基質(zhì)（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）從全身系統(tǒng)傳遞到器官、組織??和細胞。應力傳遞到細胞水平的程度在很大程度上取決于細胞周邊的機械行為、??細胞外基質(zhì)和細胞本身的相對物質(zhì)屬性。作用在細胞上的三種基本的機械應力是??拉力、壓縮力和剪切力［１２５］（圖１．３）。??Ｓｈｅａｒ??＾?Ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ??Ｔｅｎｓｉｏｎ??圖１．３細胞水平的機械應力作用??（Ｓｐａｓｉｃ?Ｍ，?ｅｔ?ａｌ．．?Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ?Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，?２０１１）??機械應力傳遞到細胞水平，產(chǎn)生的力的大小和位置取決于機械環(huán)境和細胞的??機械性能。細胞可以免受壓力，或者相反，壓力可以集中在特定的位置。細胞具??有機械感覺能力，能夠?qū)C械信號轉(zhuǎn)換成生化反應。有多種不同的機械信號作用??于細胞，有多種蛋白參與信號轉(zhuǎn)導，反應范圍從細胞骨架排列的短期變化到基因??表達的長期變化。通常，機械信號通過特化蛋白或蛋白復合物轉(zhuǎn)化為生化信號，??協(xié)調(diào)的反應使細胞適應不斷變化的機械條件，進而調(diào)節(jié)組織形態(tài)和重塑。??１２??

?第３章實驗結果與結論???第３章實驗結果與結論??３．１．?ＢＣｌ－ｅＧＦＰ細胞的貼壁培養(yǎng)及自組裝分化??ＢＣｌ－ｅＧＦＰ細胞首先在包被Ｇｅｌｔｒｅｘ的孔板里貼壁培養(yǎng)，細胞呈多角形或梭??形，細胞質(zhì)飽滿，細胞膜清晰可見并穩(wěn)定表達綠色突光蛋白（Ｇｒｅｅｎ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ??ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ），細胞核呈橢圓形，多位于細胞中央。培養(yǎng)５－７天后，貼壁培養(yǎng)的??單層細胞不斷分裂擴增，成鑲嵌樣緊密排列長滿培養(yǎng)皿。當細胞融合約９０％及以??上時，消化刮取的細胞團塊呈不定形態(tài)，邊緣卷曲，透亮，大小約４５０ｐｍ為宜，??懸浮培養(yǎng)開始自組裝成神經(jīng)球。Ｄａｙ７神經(jīng)球大小為２２０±５〇ｎｍ，內(nèi)部呈灰黑色，??組織疏松，外層透亮且較為緊致（圖３．１）。??＠■１?ＥＨ??圖３．１顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的ＢＣｌ－ｅＧＦＰ細胞和神經(jīng)球自組裝過程（標尺＝５０〇ｎｍ）??圖注：（Ａ）單層貼壁培養(yǎng)的細胞呈多角形或梭形，細胞質(zhì)飽滿，細胞膜清晰可見。（Ｂ）??單層貼壁培養(yǎng)的細胞表達ＧＦＰ。（Ｃ）細胞增殖大量融合時酶解，刮取并懸浮培養(yǎng)??的細胞團塊，大小約為４５〇ｎｍ。（Ｄ）Ｄａｙ７細胞團塊自組裝成大小為２２０±５〇ｎｍ的??神經(jīng)球，內(nèi)部呈灰黑色，組織疏松，外層透亮且緊致。??２９??


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