DNA甲基化譜式的異常可以作為腫瘤診斷、治療和預(yù)后的標(biāo)志之一。通過(guò)抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)活性,逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞中DNA甲基化譜式的異常和促進(jìn)相關(guān)抑癌基因的重新表達(dá),是一種重要的癌癥治療方法。UHRF1是維持性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1的重要輔助因子,它通過(guò)其特異的SRA結(jié)構(gòu)域結(jié)合DNA復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的半甲基化DNA并介導(dǎo)DNMT1的招募和維持性DNA甲基化。UHRF1在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),并且可以作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。我們?cè)O(shè)計(jì)了能夠抑制UHRF1蛋白的SRA結(jié)構(gòu)域結(jié)合半甲基化DNA的小分子化合物,并通過(guò)體外和細(xì)胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其效果。為了尋找靶向UHRF1的SRA結(jié)構(gòu)域的小分子化合物,陽(yáng)懷宇教授實(shí)驗(yàn)室首先通過(guò)計(jì)算化學(xué)的虛擬篩選方法獲得了116個(gè)潛在的結(jié)合SRA結(jié)構(gòu)域的小分子化合物。利用EMSA實(shí)驗(yàn),我們從116個(gè)小分子化合物中篩選出6個(gè)能夠在體外抑制UHRF1結(jié)合半甲基化DNA的化合物。通過(guò)HPLC方法檢測(cè)細(xì)胞整體的DNA甲基化水平,我們發(fā)現(xiàn)42號(hào)和68號(hào)化合物能夠在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中下調(diào)整體的DNA甲基化水平。后續(xù)我們通過(guò)CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況、Western Blot檢測(cè)UHRF1和DNMT1蛋白水平、qRT-PCR檢測(cè)干擾素信號(hào)通路基因的表達(dá)情況,我們發(fā)現(xiàn)42/68號(hào)化合物能夠抑制細(xì)胞增殖、但不影響UHRF1的轉(zhuǎn)錄及蛋白水平、也不會(huì)促進(jìn)干擾素信號(hào)通路基因的表達(dá)。此外,聯(lián)合使用42/68號(hào)化合物與DNMTs家族抑制劑雖然不能更大幅度地下調(diào)細(xì)胞的整體DNA甲基化水平,但可以更好地抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。綜上,我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)靶向UHRF1的SRA結(jié)構(gòu)域的小分子化合物,該化合物可以作為UHRF1-SRA的潛在小分子抑制劑。
【學(xué)位單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R965.1
【部分圖文】：

華東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文2在惡性增殖的細(xì)胞系中測(cè)試表型反應(yīng)，檢測(cè)小分子化合物對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期的影響。在檢測(cè)這些表型變化的同時(shí)，還要通過(guò)分子生物學(xué)等方法尋找潛在的分子機(jī)制；3）隨后在動(dòng)物體內(nèi)測(cè)試這些在體外篩選到的具有潛力的小分子化合物，檢測(cè)在腫瘤動(dòng)物模型中是否可以提供生存方面的治療益處。在動(dòng)物研究過(guò)程中，也要提供關(guān)于藥物毒性和藥代動(dòng)力學(xué)特性等信息；4）根據(jù)這些臨床前的研究結(jié)果，潛在的候選分子才可被帶入臨床環(huán)境；5）當(dāng)新藥在臨床試驗(yàn)中證明是有益的時(shí)侯，才會(huì)被FDA等監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于常規(guī)臨床治療3。圖1.1部分表觀遺傳藥物開(kāi)發(fā)的過(guò)程及當(dāng)前狀態(tài)31.2腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的表觀遺傳修飾差異基因正常有序的轉(zhuǎn)錄是機(jī)體細(xì)胞行使正常功能的前提，如果基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能失調(diào)，細(xì)胞就可能發(fā)生癌變。DNA甲基化、組蛋白修飾等是表觀遺傳調(diào)控機(jī)制的重要組成部分。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表觀遺傳修飾發(fā)生了明顯的改變。腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA甲基化譜式發(fā)生改變。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞基因組

華東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文3中的轉(zhuǎn)座子、重復(fù)序列區(qū)域的DNA甲基化水平明顯下降，導(dǎo)致基因組整體DNA甲基化水平的下降。這會(huì)促進(jìn)原先沉默的轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致基因組序列重排、基因組的不穩(wěn)定及細(xì)胞增殖異常等。相反，腫瘤細(xì)胞中抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化水平明顯升高，這會(huì)導(dǎo)致抑癌基因沉默，促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展10-12。很多研究表明，腫瘤細(xì)胞的DNA甲基化譜式可以用作定義腫瘤類型、臨床治療和預(yù)后的標(biāo)志13,14。對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的基因組進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，原先正常未甲基化的啟動(dòng)子CpG島中有5％-10％的啟動(dòng)子會(huì)發(fā)生異常高甲基化，而且啟動(dòng)子處的CpG島發(fā)生超甲基化后，不僅會(huì)影響蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)，還會(huì)影響各種非編碼RNA的表達(dá)，其中一些非編碼RNA還參與了細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化15-18。DNA甲基化與組蛋白修飾之間總是相互影響的。在正常細(xì)胞的低DNA甲基化水平的區(qū)域，組蛋白H3、H4上的修飾主要以乙�；癁橹鳎℉3/H4Ac、H3K4me2/3），而在轉(zhuǎn)座子、重復(fù)序列等高甲基化水平的區(qū)域，組蛋白H3、H4上的修飾以甲基化為主（H3K27me3、H3K9me3、H4K20me3）。當(dāng)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞后，除了上面說(shuō)到的DNA甲基化譜式發(fā)生改變外，組蛋白的修飾也隨著DNA甲基化修飾的改變而改變19。圖1.2表觀遺傳修飾在正常/癌癥細(xì)胞中的變化19

華東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文171.6靶向UHRF1的治療到目前為止，所有測(cè)試過(guò)的天然抗癌化合物都涉及抑癌基因的上調(diào)表達(dá)，同時(shí)還下調(diào)了UHRF1的表達(dá)123-125。尋找一種可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖而又不妨礙UHRF1在非癌細(xì)胞中發(fā)揮其基因組穩(wěn)定性作用的特異性抑制劑將是很有意義的。圖1.6本圖介紹了可能利用UHRF1產(chǎn)品或干擾UHRF1相關(guān)途徑的分子靶向療法111。（A）UHRF1通路，促進(jìn)癌癥進(jìn)展和弓形蟲增殖，以及通過(guò)蛋白酶體降解蛋白質(zhì)的一般過(guò)程。（B）利用干擾UHRF1相關(guān)途徑的可能療法。使用合成的UHRF1肽的UHRF1癌癥疫苗可用于癌癥治療。UHRF1靶向治療還包括UHRF1-siRNA，小分子化合物和可滲透的顯性負(fù)肽抗體療法不適合UHRF1的分子靶向治療，原因在于能夠用于抗體治療的靶向蛋白應(yīng)該是存在于體液內(nèi)或者細(xì)胞膜上的能夠被抗體識(shí)別的蛋白，而UHRF1在細(xì)胞質(zhì)中合成，在細(xì)胞核中發(fā)揮作用，所以不能使用抗體療法。UHRF1-siRNA也不適合用于癌癥患者的治療。雖然針對(duì)UHRF1的siRNA能夠抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，但是siRNA在血液中容易被血清核酸酶降解，并且它分子量小，呈負(fù)電荷，不易被腎小球重吸收而排入尿液。另外如何將siRNA準(zhǔn)確輸送到目標(biāo)位置也是另一個(gè)重要研究領(lǐng)域。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2870670