【摘要】：本論文研究工作為國家自然科學基金資助項目—"當歸-紅花配伍養(yǎng)血活血量效關系與協(xié)同增效相互作用研究"和"江蘇省方劑高技術研究重點實驗室/江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心項目"的部分實驗內容。論文共分為四章,第一章綜述了藥對和新生化顆粒的研究進展。第二章到第四章為實驗部分,其具體的研究內容和相應結論如下:第二章基于當歸系列藥對的新生化顆粒配伍效應研究第一節(jié)基于當歸系列藥對的新生化顆粒的養(yǎng)血作用配伍效應研究采用撤藥分析法比較評價當歸系列藥對在新生化顆粒中的養(yǎng)活作用貢獻,養(yǎng)血指標主要包括外周血常規(guī)參數(shù)、臟器指數(shù)、Na+-K+和Ca2+-Mg2+ATP酶活性。采用環(huán)磷酰胺和乙酰苯肼聯(lián)合復制血虛小鼠模型;與正常組小鼠相比,模型組小鼠的外周血常規(guī)、臟器指數(shù)和ATP酶活性均有顯著性差異(P0.01),表明血虛模型復制成功。給予新生化顆粒(XSHG)及新生化顆粒缺失當歸系列藥對樣品后(DY、DC、DT、DH、DJ和DZ)后,各給藥組小鼠的各相關養(yǎng)血效應的指標均有不同程度的改善。進一步將各給藥組的藥效數(shù)據(jù)經過主成分分析(PCA),采用各給藥組到空白組的相對距離法來比較當歸系列藥對在新生化顆粒中的養(yǎng)血作用。各給藥組的養(yǎng)血作用的大小順序為:XHSGDJDTDZDHDCDY。結合多指標綜合指數(shù)法的分析數(shù)據(jù),表明當歸系列藥對在新生化顆粒中藥學效應方面皆有作用,當歸-益母草和當歸-川芎藥對在方中的養(yǎng)血貢獻程度最大。該方法為新生化顆粒的臨床合理應用提供了科學依據(jù),并為復雜方劑的配伍研究提供了方法的參考。第二節(jié)基于當歸系列藥對的新生化顆粒的活血作用配伍效應研究比較評價新生化顆粒缺失當歸系列藥對前后對急性血瘀大鼠血液流變學和凝血功能的影響,探討當歸系列藥對在新生化顆粒中的活血作用貢獻。采用冰水浴和皮下注射鹽酸腎上腺素共同復制急性血瘀大鼠模型。根據(jù)全血黏度(WBV)、血漿黏度(PV)、血沉(ESR)和紅細胞壓積(HCT)等指標,觀察新生化顆粒缺失當歸系列藥對前后對急性血瘀大鼠血液流變學的影響;以血小板最大聚集率(ADP)、凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、血漿纖維蛋白原含量(FIB),觀察新生化顆粒缺失當歸系列藥對前后對血瘀大鼠的血小板聚集和凝血功能的影響。采用多指標綜合指數(shù)法和主成分分析法綜合評價當歸系列藥對在新生化顆粒中的活血作用貢獻。研究結果顯示,與正常組比較,模型組的各血液流變學和凝血功能指標均有統(tǒng)計學差異(P0.01);與模型組比較,新生化顆粒缺失當歸系列藥對前后對急性血瘀大鼠的血液流變學和凝血功能的多個指標皆有一定的改善作用。多指標綜合指數(shù)法和主成分分析法綜合評價得出,新生化顆粒對血瘀大鼠的調節(jié)作用優(yōu)于拆方組和生化湯組;新生化顆粒缺失當歸系列藥對后,各給藥組的活血效應均有一定程度的降低;缺失不同的當歸藥對后對原方的活血效應影響不同,當歸系列藥對在新生化顆粒中的活血作用貢獻的順序為:當歸-益母草當歸-川芎當歸-紅花當歸-炙甘草當歸-桃仁當歸-姜炭。該研究表明,當歸系列藥對是新生化顆粒的重要組成部分,不同的當歸系列藥對在新生化顆粒中的活血作用貢獻不同;且當歸-益母草藥對在全方中的活血作用貢獻最大,與新生化顆粒的組方結構(重用益母草)以及益母草"活血行滯、祛瘀生新"的功效相一致,與前期當歸系列藥對在新生化顆粒中的養(yǎng)血血效應貢獻度一致。第三章新生化顆粒體內外效應物質基礎研究第一節(jié)新生化顆粒配伍前后的主要效應成分含量變化研究新生化顆粒來源于經典名方生化湯,臨床上常用來治療產后疾病。它的效應成分主要包括:芳香酸類、苯酞類、生物堿類、黃酮類和姜辣素類成分。為比較新生化顆粒七個單味藥配伍前后效應成分的含量變化,本文首次建立了超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質譜法(UHPLC-TQ/MS)同時測定新生化顆粒及其單味藥中27個效應成分的含量。在優(yōu)化的色譜條件下,27 個效應成分在 20 min 內于 Thermo Scientific Hypersil GOLD(100 mm × 3 mm,1.9μm)色譜柱上得到了較好的分離。結果顯示:除了胸腺嘧啶、對香豆酸、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H和藁本內酯外,其它有效成分的含量配伍后均顯著性增加;不同類型化合物配伍前后的變化率的順序為:姜辣素類黃酮類芳香酸類生物堿類苯酞類。該方法為新生化顆粒的質量控制提供了參考,同時也有助于闡明新生化顆粒的藥物相互作用規(guī)律。第二節(jié)當歸系列藥對在新生化顆粒中的效應物質基礎研究綜合前期的活血、養(yǎng)血作用貢獻的效應整合結果,皆表明藥對當歸-益母草和當歸-川芎在方中的貢獻程度大�；诖�,從各拆方樣品中效應成分的含量變化方面揭示當歸系列藥對在新生化顆粒中不同貢獻的潛在原因。本實驗采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質譜(UHPLC-TQ-MS/MS)法比較評價新生化顆粒及其拆方樣品中有效成分的含量變化。結果表明,與新生化顆粒組相比,大部分效應成分在其拆方樣品中皆有不同程度的降低;在樣品DY中,除了甘草素外,其它效應成分較新生化顆粒中相應的成分均有不同程度的降低。進一步將各樣品中效應成分的含量做標化后做PCA分析,其中,DY和DC樣品組距XSHG組最遠,從化學成分含量角度表明了藥對當歸-益母草和當歸-川芎在新生化顆粒的貢獻程度較大的原因。該方法為闡明當歸系列藥對在新生化顆粒的配伍規(guī)律奠定了基礎。第三節(jié)新生化顆粒在正常和血虛模型大鼠體內的藥代動力學比較研究建立新生化顆粒中15個效應成分在大鼠血漿中的UPLC-MS/MS的測定方法,比較評價主要效應成分在正常和血虛模型大鼠灌胃給藥新生化顆粒后的藥物代謝動力學的行為差異。新生化顆粒在正常和血虛模型大鼠的灌胃劑量均為9.72 g·kg-1。15個效應成分在血漿中的線性關系良好(r ≥ 0.9925),所有分析物的日間和日內精密度分別小于10.88%和11.87%,相應的準確度相對誤差在±12.38%范圍內。除了甘草酸以及甘草次酸,新生化顆粒中其它效應成分在正常和血虛模型大鼠中Tmax和t1/2均較短,在6小時內基本消除完全;較空白組相比,模型組中除了苦杏仁苷、甘草苷和甘草次酸,其它效應成分的藥動學行為均有明顯的差異;整體而言,各類效應成分在模型大鼠中的AUC0-t、AUC0-∞均明顯高于正常大鼠(P0.05),Tmax均有不同程度的提前。表明在血虛病理狀態(tài)下,通過激活血虛大鼠體內的代謝酶的活力,使得效應成分的代謝速率和程度被改變。其中,以水蘇堿和益母草堿為代表的生物堿類,在體內較長時間保持較高的血藥濃度,提示生物堿類成分可能是新生化顆粒發(fā)揮養(yǎng)血效應的重要活性成分,其養(yǎng)血作用機理需要進一步研究。第四章基于代謝組學和網(wǎng)絡藥理學的新生化顆粒養(yǎng)血作用機制研究第一節(jié)基于代謝組學的新生化顆粒的養(yǎng)血作用機制研究采用大鼠眼底靜脈叢放血法復制大鼠失血性血虛模型,共分為失血性模型組、正常組、新生化顆粒組、生化湯組、當歸-益母草組,當歸組和益母草組。應用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質譜(UHPLC-Q-TOF/MS)技術,對各組大鼠血漿中內源性代謝物進行分析,采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)對血漿中內源性標記物進行多元數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,并基于SPSS19.0對潛在差異性標記物進行P檢驗。結果顯示,PCA中血虛大鼠與其他各組能夠達到基本分離;進一步對潛在的差異性標記物定性鑒定,共鑒定出18個差異性標記物。與正常組相比,模型組中8-異前列腺素F2a、神經鞘氨醇、溶血卵磷脂LysOPC(20:4)、磷酸泛酰半胱氨酸、15-脫氧-d-12,14-前列腺素J2、脫氧膽酸、脫氧核糖胸腺苷酸、9-反式-視黃酸、亮氨酸-苯丙氨酸、L-胱硫醚、泛醌-2、鞘氨醇1-磷酸、S-腺苷高半胱氨酸、16-羥基孕烯醇酮和4-氧化-視黃酸的含量顯著增加(P0.01);模型組中16-去氫黃體酮、二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸的含量明顯降低(P0.05)。在各給藥組的大鼠體內,這些差異性內源性物質得到了不同程度的恢復。采用Matlab構建血虛相關通路分析,失血性血虛模型主要泛酸和輔酶A的生物合成、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、鞘脂類代謝有關。不同給藥組可以調節(jié)以上紊亂的3條代謝通路向正常轉歸,其藥效學和內源性標記物的代謝軌跡的結果均顯示,不同給藥組對失血模型大鼠的改善程度為:XSHGSHDDYDGYMC。第二節(jié)基于網(wǎng)絡藥理學的新生化顆粒的養(yǎng)血作用靶點預測采用網(wǎng)絡藥理學方法對新生化顆粒中58個潛在效應成分的養(yǎng)血分子作用機制進行分析,探討其多成分、多靶點、多通路的相關關系。依據(jù)PharmMapper、SEA、STITCH、Drugbank等數(shù)據(jù)庫和文本挖掘的方法構建了與46個血虛相關的靶蛋白;然后將獲得靶蛋白導入KEGG數(shù)據(jù)庫建立血虛相關作用通路;最后,采用Cytoscape軟件建立新生化顆粒成分-靶點-通路網(wǎng)絡模型。養(yǎng)血效應方面,新生化顆粒中58個效應成分涉及46個作用蛋白和24條作用通路;24條作用通路主要涉及血虛過程中的紅細胞功能、免疫功能、能量代謝、炎癥因子和血管微循環(huán);其中,預測到的24條血虛代謝通路與前期的代謝組學有7條吻合。文獻研究和本課題組的代謝組學研究結果均證實了網(wǎng)絡預測的可靠性。該結果體現(xiàn)了新生化顆粒的多成分、多靶點、多途徑作用模式,為深入研究新生化顆粒的養(yǎng)血的分子作用機制提供參考。第三節(jié)新生化顆粒養(yǎng)血效應的關鍵靶點驗證課題組前期采用代謝組學和網(wǎng)絡藥理學對新生化顆粒的養(yǎng)血機制進行了探索性研究。研究結果均表明,產后血虛證主要和能量代謝紊亂、血液微循環(huán)障礙、紅細胞合成降低、炎癥爆發(fā)以及免疫功能降低有關�；谝陨系姆治鼋Y果,本節(jié)對新生化顆粒潛在養(yǎng)血代謝通路上的關鍵靶蛋白進行了生物活性驗證。研究結果發(fā)現(xiàn),新生化顆粒通過提高機體的EPOR、F2、TNF-α、IL-6、ACSS1、COASY、AHCY 和 CBS 的表達,降低體內 S1PR1、SPHK1和HIF-1α的含量,繼而改善血虛狀態(tài)下的能量代謝紊亂、血液微循環(huán)障礙和增強紅細胞功能而發(fā)揮養(yǎng)血作用。
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
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本文編號：2534306