本文選題：桂皮醛　切入點：非小細胞肺癌　出處：《南京中醫(yī)藥大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究目的:桂皮醛(Cinnamaldehyde,CA),是中藥肉桂揮發(fā)油中的一種主要提取物。本課題組前期體外實驗研究發(fā)現(xiàn):CA對多株腫瘤細胞具有誘導(dǎo)凋亡和抑制侵襲轉(zhuǎn)移的功效,而其中的作用機制尚未明確闡明。此外,結(jié)合理論和前期研究我們發(fā)現(xiàn),上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移機制之一。因此本課題組擬研究桂皮醛對人非小細胞肺癌細胞凋亡和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響,進一步探討CA抑制非小細胞肺癌的可能機制,為中醫(yī)藥治療肺癌提供新的理論依據(jù)。研究方法:1采用MTT法,觀察CA對非小細胞肺癌細胞A549,YTMLC-90,NCI-H1299的增殖抑制作用。2采用流式細胞術(shù)(Flowcytometry,FCM)和Hoechst 33258染色實驗,研究CA對A549,YTMLC-90,NCI-H1299細胞凋亡比例和染色質(zhì)形態(tài)的影響。3采用CoCl2構(gòu)建缺氧模型,倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。4采用劃痕實驗檢測細胞遷移能力的變化。5采用Transwell小室侵襲實驗檢測細胞侵襲能力的變化。6 采用 RT-qPCR 法檢測 CA 對 A549,YTMLC-90,NCI-H1299 細胞中凋亡、EMT、侵襲轉(zhuǎn)移及Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因表達的影響。7 采用 Western blotting 實驗檢測 CA 對 A549,YTMLC-90,NCI-H1299 細胞中凋亡、EMT、侵襲轉(zhuǎn)移及Wnt/β-catenin通路蛋白表達的影響。8采用免疫熒光實驗檢測CA對A549,YTMLC-90,NCI-H1299細胞中β-catenin胞漿聚集及核轉(zhuǎn)位表達的影響。9采用人肺腺癌細胞A549建立裸鼠皮下移植瘤模型,腹腔注射給藥,測量并計算CA對移植瘤體積和質(zhì)量的抑制率。10采用RT-qPCR、Western blotting、免疫組織化學(xué)方法檢測移植瘤組織中Wnt/β-catenin通路活性及凋亡、EMT、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的變化。研究結(jié)果:1 MTT實驗提示,CA能有效抑制非小細胞肺癌細胞A549,YTMLC-90,NCI-H1299增殖,并呈現(xiàn)劑量、時間依賴性。2流式細胞術(shù)結(jié)果提示CA能誘導(dǎo)A549,YTMLC-90,NCI-H1299細胞凋亡且與濃度呈正相關(guān)。Hoechst33258熒光染色實驗觀察到CA使得細胞核出現(xiàn)核固縮及碎裂。3 RT-qPCR 實驗結(jié)果顯示,CA 作用于 A549,YTMLC-90,NCI-H1299 細胞后,Bcl-2、Bcl-xl基因表達下降,Bax基因表達上升。Western blotting實驗結(jié)果顯示,CA作用于A549細胞后,Bcl-2、Bcl-xl、Caspase-3、PARP 蛋白表達下降,Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表達上升。4 CoCl2作用于A549,YTMLC-90,NCI-H1299細胞后,細胞呈現(xiàn)出紡錘狀間質(zhì)形態(tài)。劃痕實驗、Transwell小室侵襲實驗檢測出CoCl2誘導(dǎo)的缺氧環(huán)境可顯著增強細胞的遷移、侵襲能力。5 RT-qPCR 實驗結(jié)果顯示,CoCl2 作用于 A549,YTMLC-90,NCI-H1299 細胞后,N-cadherin、Vimentin、Snail、Twist、MMP-2、MMP-9、MMP-14 基因表達上升,E-cadherin基因表達下降。Western blotting實驗結(jié)果顯示,CoCl2作用于細胞后,HIF-1α、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9 蛋白表達增強,E-cadherin 蛋白表達減弱。6 CA作用于CoCl2誘導(dǎo)的A549,YTMLC-90,NCI-H1299細胞后,劃痕實驗、Transwell小室侵襲實驗結(jié)果顯示CA能夠有效降低CoCl2誘導(dǎo)的細胞遷移、侵襲能力。RT-qPCR及Western blotting實驗結(jié)果顯示,CA顯著抑制了 CoCl2誘導(dǎo)的細胞MMPs表達及EMT。7 RT-qPCR 及 Western blotting 實驗結(jié)果顯示,CoCl2 能夠顯著增強 A549,YTMLC-90,NCI-H1299細胞中β-catenin、Cyclin-D1表達并促進β-catenin核聚集,而CA能有效地抑制Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因活性。免疫熒光實驗結(jié)果顯示CoCl2誘導(dǎo)了β-catenin的胞漿聚集與核轉(zhuǎn)移,而該促進作用可被CA有效抑制。8 特異性激動劑LiCl作用于 A549,YTMLC-90,NCI-H1299 細胞后,Wnt/β-catenin通路活性隨之被激活,同時細胞遷移、侵襲能力增強,且Western blotting實驗證實Wnt/β-catenin通路的激活可誘導(dǎo)細胞發(fā)生EMT。相反,特異性抑制劑XAV939作用于CoCl2誘導(dǎo)的A549,YTMLC-90,NCI-H1299細胞后,Wnt/β-catenin通路活性降低的同時,細胞遷移、侵襲能力減弱,細胞EMT被逆轉(zhuǎn)。此外,Western blotting實驗結(jié)果顯示,CA能逆轉(zhuǎn)A549,YTMLC-90,NCI-H1299細胞EMT且效力較XAV939相似,而LiCl在激活了Wnt/β-catenin通路的同時,能夠部分逆轉(zhuǎn)CA對細胞EMT的抑制作用。9體內(nèi)裸鼠移植瘤模型中,CA應(yīng)用后腫瘤的瘤體積較空白組明顯減小,腫瘤的質(zhì)量與空白組比較也有所下降,低、高劑量組的腫瘤生長均受到抑制。10 RT-qPCR及Western blotting實驗證實,裸鼠移植瘤經(jīng)CA腹腔注射后,腫瘤組織中促凋亡基因表達上調(diào),抑凋亡基因表達下調(diào);間質(zhì)樣分子表達被抑制;Wnt/β-catenin活性亦減弱,且均呈明顯的劑量依賴性。免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果顯示,隨著CA濃度提高,腫瘤組織中Cleaved PARP、E-cadherin表達遞增,β-catenin表達則隨之遞減。研究結(jié)論:1桂皮醛能有效抑制人非小細胞肺癌細胞A549,YTMLC-90,NCI-H1299增殖并通過增加Bax/Bcl-2比例、活化Caspase-3、PARP誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。2桂皮醛能抑制人非小細胞肺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進而起到抗侵襲轉(zhuǎn)移的功效。3桂皮醛能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路,逆轉(zhuǎn)人非小細胞肺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
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【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R273

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳嘉璐;李ng健;張云婷;;溫陽益髓方對于肺癌化療患者骨髓抑制的臨床觀察和實驗研究[J];遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報;2016年11期

2 彭仁通;;溫陽法聯(lián)合TP方案治療晚期非小細胞肺癌臨床研究[J];中醫(yī)學(xué)報;2016年02期

3 王珊珊;郭茗;朱W，

本文編號：1689034