本文選題：胎兒真皮間充質(zhì)干細胞　切入點：瘢痕疙瘩　出處：《山東大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景瘢痕疙瘩是一種由成纖維細胞異常增殖和膠原過度沉積導致的皮膚纖維化疾病。由于該疾病形成機制復雜,目前研究尚未能完全揭示其發(fā)病原因和生長機制,臨床上也未出現(xiàn)效果理想的治療方案,所以新的治療方案亟待出現(xiàn)。間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)因其抗纖維化作用已在肺纖維化、心肌梗塞等纖維化疾病治療方面嶄露頭角,而人胎兒真皮間充質(zhì)干細胞(Fetal dermal mesenchymal stem cells,FDMSCs)被認為在早期胎兒無瘢痕愈合中起到?jīng)Q定性作用的細胞,但是,該細胞是否可應(yīng)用于瘢痕疙瘩的治療方面還未見文獻報道。目的通過研究 FDMSCs 條件培養(yǎng)基(FDMSCs conditioned medium,F-CM)對瘢痕疙瘩成纖維細胞(Keloid fibroblasts,KFs)生物學活性的影響,探索FDMSCs相關(guān)療法治療瘢痕疙瘩的可行性。方法分別提取并鑒定成人真皮成纖維細胞(Adult dermal fibroblasts,ADFs)、FDMSCs和KFs,并應(yīng)用ADFs和FDMSCs制備ADFs條件培養(yǎng)基(ADFs conditioned medium,A-CM)和 F-CM。KFs 分別用空白對照培養(yǎng)基(SFM)、A-CM和F-CM培養(yǎng),培養(yǎng)48h后對各組KFs進行一系列實驗分析,包括細胞形態(tài)觀察(倒置顯微鏡下)、細胞數(shù)量變化(MTT比色實驗)、細胞增殖率和凋亡率改變(BrdU細胞增殖實驗和TUNEL細胞凋亡實驗)、細胞共培養(yǎng)干預(yù)實驗和條件培養(yǎng)基干預(yù)實驗對比、凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達變化(qPCR和Western blot)、細胞凋亡時期檢測(Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測)結(jié)果通過一系列實驗,結(jié)果顯示相對于對照組和A-CM組,F-CM可以誘導KFs出現(xiàn)凋亡形態(tài),并可減少活細胞的數(shù)目。但KFs增殖率沒有明顯改變但凋亡率明顯增加,這說明細胞數(shù)目的減少主要得益于細胞凋亡的增多。FDMSCs與KFs共培養(yǎng)實驗的結(jié)果同培養(yǎng)基干預(yù)KFs實驗結(jié)果沒有明顯區(qū)別。進一步實驗表明F-CM可促進細胞促凋亡蛋白BCL-2的表達并抑制細胞抑凋亡蛋白BAX的表達,導致BCL-2/BAX升高而促進細胞凋亡。Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡實驗結(jié)果表明細胞凋亡時期主要為晚期凋亡。結(jié)論(1)FDMSCs可成功從早期人胎兒皮膚中提取并進行體外培養(yǎng)、傳代,并能維持穩(wěn)定的生物學特性。(2)F-CM干預(yù)KFs實驗結(jié)果與細胞共培養(yǎng)干預(yù)實驗結(jié)果一致,避免了 FDMSCs直接應(yīng)用于機體的潛在風險。(3)F-CM可以通過抑制細胞抑凋亡蛋白BCL-2的表達并促進細胞促凋亡蛋白BAX的表達來促進細胞凋亡。(4)F-CM所誘導的KFs凋亡時期主要為晚期凋亡。
[Abstract]:Background keloid is a disease of skin fibrosis caused by abnormal proliferation of fibroblasts and excessive deposition of collagen. There is no ideal therapeutic plan in clinic, so a new treatment is urgently needed. Mesenchymal stem cells (MSCs) have emerged in the treatment of pulmonary fibrosis, myocardial infarction and other fibrosis diseases because of its anti-fibrosis effect. Human fetal dermal mesenchymal stem cells (Fetal dermal mesenchymal stem cells FDMSCs) are thought to play a decisive role in early fetal scarless healing, however, It has not been reported whether this cell can be used in the treatment of keloid. Objective to study the effect of FDMSCs conditioned medium conditioned mediumF-CMon on the biological activity of keloid fibroblasts (KFs). To explore the feasibility of FDMSCs related therapy in the treatment of keloid. Methods FDMSCs and FDMSCs were used to prepare ADFs conditioned medium conditioned mediumA-CMCs and F-CM.KFs were cultured in blank control medium SFMA-CM and F-CM respectively. After 48 hours of culture, a series of experiments were carried out on KFs in each group. The cell morphology was observed under inverted microscope, the cell number was changed by MTT colorimetric assay, the cell proliferation rate and apoptosis rate were changed by BrdU cell proliferation test and TUNEL cell apoptosis test, the cell co-culture intervention experiment and the conditioned medium intervention experiment were compared. The expression of apoptosis-related genes and proteins was detected by qPCR and Western blottir. The results of apoptosis detection of Annexin V-FITC / Pi double staining cells showed that F-CM could induce apoptosis of KFs compared with control group and A-CM group. But the proliferation rate of KFs did not change obviously, but the apoptosis rate increased obviously. This indicated that the decrease of cell number was mainly due to the increase of apoptosis. The results of co-culture of FDMSCs and KFs were not significantly different from those of medium intervention in KFs. Further experiments showed that F-CM could promote apoptosis protein BCL-2. And inhibit the expression of BAX, a cell inhibitor of apoptosis, The results showed that the apoptosis stage was mainly late apoptosis. Conclusion BCL-2/BAX can be successfully extracted from the early human fetal skin and cultured in vitro. The results of F-CM intervention in KFs were consistent with those of co-culture. In order to avoid the potential risk of direct application of FDMSCs, F-CM can promote the apoptosis of KFs by inhibiting the expression of BCL-2 and promoting the expression of apoptosis-promoting protein BAX. The apoptosis stage of KFs induced by F-CM is mainly late apoptosis.
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R622

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