本文關(guān)鍵詞： 單克隆抗體 甘草酸 免疫親和色譜 敲除 抗炎　出處：《北京中醫(yī)藥大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:制備甘草酸免疫親和色譜柱,特異性敲除甘草提取液中的甘草酸,對比敲除前后甘草提取液的抗炎效果;對比三種常用藥用甘草:烏拉爾甘草、脹果甘草及光果甘草的抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)是否存在差異。1.甘草酸免疫親和色譜柱的方法學(xué)考察,考察免疫親和色譜柱的特異性,載樣量,敲除率,穩(wěn)定性,精密度與準(zhǔn)確度等參數(shù)。2.利用制備的甘草酸免疫親和色譜柱特異性敲除甘草提取液中的甘草酸等成分,通過HPLC及LC/MS鑒定敲除成分。3.對比甘草提取液敲除前后抗炎作用差異,分析甘草酸與甘草抗炎作用的關(guān)聯(lián)性。4.對比三種不同甘草敲除前后抗炎作用的差異,分析不同種類甘草的抗炎作用物質(zhì)基礎(chǔ)的差異。方法:利用小鼠腹水生產(chǎn)法制備大量抗甘草酸單克隆抗體,制備甘草酸免疫親和色譜柱,對甘草提取液進(jìn)行敲除研究,對比不同甘草敲除甘草酸前后抗炎作用的差異。1.小鼠腹水生產(chǎn)法大量生產(chǎn)抗甘草酸單克隆抗體,測定抗體的效價以及交叉反應(yīng)與競爭性,確定抗體的特異性。并采用辛酸-硫酸銨法純化腹水,通過SDS-PAGE鑒定抗甘草酸腹水抗體純化情況。2.利用純化好的抗甘草酸單克隆抗體與CNBr活化的瓊脂糖凝膠偶聯(lián)制備甘草酸免疫親和色譜柱。偶聯(lián)過程包括:凝膠的活化與溶脹、凝膠清洗、抗體偶聯(lián)、封閉、裝柱、平衡等過程,制備了免疫親和色譜柱�？疾炝酥苽涞纳V柱的偶聯(lián)率、特異性、載樣量、精密度、準(zhǔn)確度與穩(wěn)定性等色譜柱參數(shù),從而對色譜柱的效能進(jìn)行評價。3.取2.0mg/mL的甘草提取液1.OmL,通過甘草酸免疫親和色譜柱,經(jīng)上樣、敲除、洗脫、平衡步驟,敲除甘草提取液中甘草酸類成分,利用HPLC測定甘草提取液敲除前后的色譜圖譜,通過LC/MS技術(shù)對敲除成分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析鑒定。4.通過甘草酸免疫親和色譜柱敲除三種甘草提取液中的甘草酸,以LPS誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7分泌IL-6及TNF-α為指標(biāo),通過對比敲除前后三種甘草的藥效作用,觀察甘草酸在甘草抗炎研究中對炎癥細(xì)胞分泌IL-6及TNF-α的抑制作用。并對比三種甘草提取液敲除前后對IL-6及TNF-α分泌的抑制作用,分析三種甘草抗炎作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。結(jié)果:1.經(jīng)測定,甘草酸腹水的效價能達(dá)到1:64000,且抗體的競爭性良好,其線性范圍為78.12-2500.0 ng/mL之間,在線性范圍內(nèi)建立線性回歸方程,回歸方程為:y =-0.189ln(x)+ 1.7113,(R2=0.9973)。交叉反應(yīng)結(jié)果顯示,甘草酸的單抗腹水除與甘草次酸有交叉反應(yīng)(31.57%)外,與其他類化合物則不產(chǎn)生交叉。對抗甘草酸腹水進(jìn)行純化,經(jīng)SDS-PAGE鑒定,純化后的單抗純度達(dá)到98%。2.制備了甘草酸免疫親和色譜柱,經(jīng)蛋白定量計(jì)算,甘草酸單抗與瓊脂糖凝膠的偶聯(lián)率為74.9%,偶聯(lián)比5.99:1。采用去離子水-甘氨酸鹽酸(pH=2.7)緩沖液作為色譜柱的緩沖液系統(tǒng),考察色譜柱的最大載樣量達(dá)到1 326.11 μg(110.51 μg/g凝膠),穩(wěn)定性試驗(yàn)表明在32天以內(nèi),親和色譜柱敲除率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值為1.37%,即色譜柱具有良好的穩(wěn)定性,精密度與準(zhǔn)確度考察結(jié)果顯示敲除不同濃度甘草酸樣品所得到的回收率的RSD=0.65%,RE=0.37%,符合方法學(xué)要求。3.對三種甘草提取液敲除結(jié)果表明,甘草酸免疫親和色譜柱能特異性敲除提取液中的:18β甘草酸、甘草皂苷A3、甘草皂苷G2、22-乙酰氧基甘草酸、烏拉爾甘草皂苷A單銨鹽、云甘苷G1、18α-甘草酸。4.研究三種甘草提取液敲除前后對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥的抑制作用,結(jié)果顯示,烏拉爾甘草提取液組中IL-6及TNF-α含量分別為1.27±0.009pg/mL、7.63±0.100 pg/mL,低于LPS組中IL-6及TNF-α水平(1.31±0.006pg/mL、7.95±0.107pg/mL),且差異有顯著性(P0.05);烏拉爾甘草敲除液組中IL-6及TNF-α含量分別為7.89±0.013 pg/mL、1.33±0.055 pg/mL,與LPS組差異無顯著性(P0.05);烏拉爾甘草提取液敲除前后IL-6及TNF-α含量有顯著性差異(P0.05),脹果甘草及光果甘草提取液敲除液前后的IL-6及TNF-α含量無顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)首次制備了甘草酸免疫親和色譜柱,并將其應(yīng)用于甘草提取液的成分敲除研究;本實(shí)驗(yàn)首次通過免疫親和色譜技術(shù)制備敲除甘草酸成分的甘草提取液陰性樣本,結(jié)果表明甘草酸是甘草抗炎作用的主要活性成分;本實(shí)驗(yàn)首次對比三種不同甘草敲除陰性樣本的抗炎功效,結(jié)果表明,烏拉爾甘草中主要抗炎活性成分為甘草酸,而光果甘草及脹果甘草除甘草酸外還存在其他特殊的抗炎活性物質(zhì)。
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【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：O657.7;R284.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1502653